苦瓜降糖多肽P的基因克隆及其降血糖活性的研究

论文摘要

多肽P（polypeptide-P）是存在于苦瓜种子中的由166个氨基酸组成的多肽类化合物,动物及临床试验表明其具有显著降血糖效果。研究者已从苦瓜中分离得到多肽P并测定得到其氨基酸序列,但未曾获得其基因序列信息。本论文利用简并RT-PCR和染色体步移等技术,从苦瓜中克隆得到498 bp成熟多肽P的编码序列,同源比对未发现同源性序列。成功构建了pET32a-polypeptide P原核表达载体,原核表达的重组多肽P经SDS-PAGE电泳分析,该重组多肽分子量约为44 kDa,且90%以上为上清表达。原核表达的多肽P经Ni-NTA亲和柱纯化后能得到单一条带,Western blotting进一步鉴定该蛋白即重组多肽P蛋白。纯化后的重组蛋白经四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠验证同样具有显著的降血糖效果（P<0.01）,融合标签不影响目的蛋白的生物学功能。通过对苦瓜降糖多肽P的基因克隆、原核表达、纯化和生物学功能鉴定证明了原核表达重组蛋白同样具有显著降血糖效果,为降血糖药物的开发及大规模生产提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第1章 综述
• 1.1 糖尿病概述
• 1.1.1 糖尿病的现状
• 1.1.2 糖尿病类型及特点
• 1.1.3 糖尿病的治疗手段
• 1.2 苦瓜的药理作用
• 1.2.1 苦瓜概述
• 1.2.2 苦瓜的药理性质
• 1.2.3 苦瓜中的降血糖活性成分
• 1.2.4 苦瓜降糖多肽P
• 1.3 苦瓜的降血糖作用机理
• 1.3.1 促进β细胞分泌胰岛素
• 1.3.2 类胰岛素作用
• 1.3.3 抑制葡萄糖的吸收
• 1.3.4 抑制β细胞凋亡、促进β细胞增值和修复
• 1.3.5 胰腺外作用
• 1.4 苦瓜降血糖药物的应用前景及面临的挑战
• 1.5 本课题的研究内容及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 细菌培养基
• 2.1.4 缓冲液
• 2.1.5 菌种
• 2.1.6 载体
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 苦瓜种子总RNA提取
• 2.2.2 RT-PCR
• 2.2.3 cDNA末端快速扩增（RACE）
• 2.2.4 苦瓜基因组DNA提取——改良CTAB法
• 2.2.5 染色体步移（Genome Walking）
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 大肠杆菌的转化
• 2.2.8 重组蛋白诱导表达
• 2.2.9 菌体破碎
• 2.2.10 目的蛋白表达鉴定
• 2.2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.12 融合蛋白Ni-NTA纯化
• 2.2.13 Western blotting
• 2.2.14 Bradford法检测蛋白浓度
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 苦瓜种子总RNA提取
• 3.1.1 分光光度法检测提取的苦瓜种子RNA的纯度
• 3.1.2 提取的苦瓜种子总RNA的电泳检测
• 3.1.3 保温法检测总RNA的稳定性
• 3.1.4 RT-PCR进行RNA完整性检测
• 3.2 简并PCR获取多肽P基因中间片段
• 3.3 苦瓜多肽P基因cDNA末端快速扩增（RACE）结果分析
• 3.3.1 3'RACE结果分析
• 3.3.2 5'RACE结果分析
• 3.4 苦瓜基因组DNA的提取
• 3.4.1 分光光度法检测提取的苦瓜基因组DNA的纯度
• 3.4.2 提取的苦瓜基因组DNA的电泳检测
• 3.5 染色体步移（Genome Walking）法克隆苦瓜多肽P基因未知末端
• 3.5.1 第一次3'-末端染色体步移结果分析
• 3.5.2 第二次3'-末端染色体步移结果分析
• 3.5.3 第一次5'-末端染色体步移结果分析
• 3.5.4 第二次5'-末端染色体步移结果分析
• 3.5.5 内含子鉴定
• 3.6 成熟多肽P编码序列的获取
• 3.7 重组多肽P的表达与纯化
• 3.7.1 pET32a-polypeptide P表达载体的构建
• 3.7.2 重组多肽P的表达及纯化
• 3.7.3 重组多肽P的Western blotting鉴定
• 3.8 重组多肽P的药理研究
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢