底物捕获法检测SHP1在MAPK信号通路中的靶蛋白

论文摘要

SHP1是一种胞质蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatase, PTP）,主要表达于造血细胞和某些上皮细胞。其在造血细胞中的主要功能是抑制细胞生长、增殖及分化。但在某些上皮细胞或异常表达该基因的某些实体瘤细胞中,SHP1的功能尚不明确,一些研究表明SHP1正向调控EGF诱导MAPK信号通路的活化,促进相应细胞生长,但是并不清楚其具体作用机制。一个重要原因是在实体瘤细胞中并不了解SHP1参与调节MAPK信号通路的作用底物。本研究旨在利用底物捕获技术检测SHP1在MAPK信号通路中的靶蛋白,并构建稳定表达SHP1底物捕获突变体的细胞株,为SHP1在MAPK信号通路中靶蛋白的进一步鉴定提供基础。一底物捕获法检测SHP1在MAPK信号通路中的靶蛋白实验中构建了SHP1CSDA-Flag、SHP1DAQA-Flag、SHP1TA-Flag的SHP1底物捕获突变体,重组质粒转染HEK293细胞,饥饿细胞16h后,EGF刺激细胞,细胞上清经Flag抗体免疫共沉淀,SDS-PAGE电泳、转印、磷酸化酪氨酸抗体免疫印迹检测与SHP1及其突变体相互作用的信号蛋白。结果显示EGF刺激后,在表达SHP1CSDA-Flag的HEK293细胞中,检测到一约90KD大小酪氨酸磷酸化蛋白,而在表达野生型SHP1-Flag的HEK293细胞中则检测不到这一蛋白,且在未经EGF刺激的表达野生型或突变型SHP1-Flag的HEK293细胞中均未检测到这一90KD酪氨酸磷酸化蛋白,说明此90KD蛋白可能为SHP1参与EGF活化MAPK信号通路的靶蛋白之一。二稳定表达SHP1CSDA-Flag细胞株的构建由于SHP1-Flag的CSDA双突变体可以捕获SHP1在MAPK信号通路中的90KD靶蛋白,但是利用一些相应大小的抗体却未能鉴定这一蛋白,因此必须通过其他手段鉴定该蛋白。本研究利用Invitrogen公司的Flp-InTM系统建立了稳定表达SHP1CSDA-Flag的细胞株—Flp-InTM-293-SHP1CSDA-Flag。Western blot实验证实SHP1CSDA-Flag可高效特异表达。细胞上清经Flag抗体免疫共沉淀后,磷酸化酪氨酸抗体免疫印迹检测到与SHP1CSDA-Flag相结合的90KD靶蛋白。因此只要通过大规模培养该细胞株（约1×109个细胞）并借助于Flag抗体的免疫共沉淀实验获取足够量的90KD蛋白,就有可能通过蛋白质组学方法鉴定该蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 综述 SHP1 在细胞信号转导中的作用
• 概述
• 1 SHP1 结构及活化机制
• 2 SHP1 的生物学功能
• 2.1 SHP1 在造血细胞中的作用
• 2.2 SHP1 在某些实体瘤细胞中的作用
• 3 SHP1 的作用底物
• 3.1 底物捕获法检测PTPs 底物原理
• 3.2 已成功捕获的SHP1 底物
• 总结
• 参考文献
• 第二章 底物捕获法检测SHP1 在 MAPK 信号通路中的靶蛋白
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 底物捕获突变点的选取
• 1.2.2 点突变 PCR 原理
• 1.2.3 真核表达各突变型 SHP1-Flag 的构建
• 1.2.4 SHP1-Flag 及其突变体的表达
• 1.2.5 MAPK 信号通路中SHP1-Flag 靶蛋白的检测
• 2 结果
• 2.1 真核表达SHP1-Flag 底物捕获突变体的构建
• 2.2 SHP1-Flag 及其底物捕获突变体的表达
• 2.3 SHP1 在MAPK 信号通路中作用底物的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 稳定表达SHP1CSDA-FLAG 细胞株的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒 pcDNA5/FRT-SHP1CSDA-Flag 的构建及鉴定
• 2.2 潮霉素 B 工作浓度的确定
• 2.3 亚克隆的挑选
• 2.4 β-半乳糖苷酶筛选阳性克隆
• 2.5 Western blot 鉴定阳性克隆
• 2.6 SHP1CSDA-Flag 相互作用 90KD 蛋白的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢