热休克蛋白70在紫外线致DNA损伤修复中的作用

论文摘要

真核生物和原核生物在高温、接触毒物和其它各种应激因素（如烟碱、一氧化碳、重金属、电离辐射、缺血缺氧等）等有害因素作用时，生物体会迅速启动高度程序化的热休克反应（heat shock response，HSR），诱导合成一组高度保守的热休克蛋白质（heat shock proteins，Hsps）。Hsps是生物界（包括从细菌到人的生物）经过长期进化仍旧保留下来的、对体内外不良因素起保护作用的一类蛋白质。根据Hsps在SDS-PAGE上的结果，按其分子量大小将Hsps分为如下几个家族：大分子HSPs（≥100 kD），HSP90（81-99 kD），HSP70（65-80 kD），HSP60（55-64kD），HSP40（35-54 kD），小分子HSPs（≤34 kD），其中最为主要和重要的是HSP70家族的Hsp70。许多研究提示了其可能的作用和功能如下：1)Hsp70保护细胞或生物免遭各种应激因素的损害，赋予它们从各种应激中恢复的能力；其中，表现最为明显的是热耐受能力的形成，即当细胞或生物接触亚致死温度后，表现对致死温度的存活率明显增加；2)Hsp70对保护细胞内重要遗传物质DNA可能具有重要作用，且在生物生长、发育和分化过程中也起着重要作用；3)Hsp70与体内许多重要生物活性物质（如类固醇、肿瘤坏死因子等）有着密切的联系，参与体内许多调节过程；4)更重要的是，Hsp70作为分子伴侣，促进蛋白质的合成、折叠、装配和运输，还参与变性蛋白质的清除，这种重要功能可能与热耐受、毒物耐受有关。Hsp70正常时分布在细胞浆，而有害因素应激时则分布在细胞核，且分布于染色体周围，这个重要现象提示了Hsp70在DNA保护中的可能作用与意义。DNA修复是一个重要的研究方向，而大多数研究均只从不同的DNA修复来研究它们的重要作用与机制，但很少同时考虑到DNA损伤，更少考虑到重要蛋白质在DNA损伤与修复平衡中的作用。Hsp70是重要的分子伴侣，参与蛋白质的合成、折叠、装配和运输以及变性蛋白质的清除等，无疑它也可能与DNA损伤和修复相关酶的合成和功能有关。本研究通过构建Hsp70表达升高和降低两种细胞模型，用紫外线C作为DNA损伤剂，利用彗星实验、Western-blot技术、实时定量RT-PCR等方法来观察Hsp70表达不同水平细胞中的DNA损伤和修复情况，来探讨Hsp70在DNA损伤和修复过程的可能作用。本研究共分三部分。第一部分Hsp70过表达及Hsp70表达抑制细胞模型的建立对于Hsp70过表达细胞模型的建立，我们采用pcDNA3.0／hsp70重组质粒进行细胞转染并用G418筛选稳定的Hsp70高表达细胞株（A549／hsp70）。空载体质粒pcDNA3.0转染细胞作为平行转染对照（A549／pcDNA）。对于Hsp70表达抑制细胞模型的建立我们用了槲皮素抑制Hsp70表达和RNA干扰技术两种方法并进行了比较。槲皮素（quercetin）是一种广泛存在的生物黄酮类物质，可以抑制某些肿瘤细胞Hsp70的合成，使细胞Hsp70表达降低。我们首先采用不同浓度槲皮素（50、100、150、200μmol／L）处理A549细胞6h，用MTT实验和Western-blot技术检测槲皮素处理后的A549细胞中Hsp70蛋白的表达。结果发现，随槲皮素浓度的增加，A549细胞的Hsp70的表达呈下降趋势，50μmol／L槲皮素处理Hsp70表达未见显著下降（P＞0.05）、100μmol／L处理组Hsp70表达显著降低（P＜0.05），150μmol／L和200μmol／L处理组Hsp70表达显著降低（P＜0.01）；结合MTT实验，最终确定150μmol／L槲皮素处理6h来作为Hsp70表达抑制的模型（A549／quercetin），0.01％的DMSO处理作为溶剂对照（A549／DMSO）。RNA干扰是近年来发展起来的一种研究基因功能的新方法。将NPY-1、NPY-2、NPY-3和NPY-4四种质粒瞬时转染A549细胞，48h后分别用RT-PCR和Western-blot技术检测其mRNA和蛋白质的表达。结果发现，NPY-4相对于其它三种质粒子，能有效干扰A549细胞中Hsp70表达，与A549组相比，NPY-4质粒转染组Hsp70mRNA水平下降34.07％，Hsp70蛋白相对表达下降14.23％。但与150μmol／L槲皮素处理6h相比，抑制Hsp70表达的效率较低。综合比较，最终选用150μmol／L槲皮素处理A549细胞6h来作为抑制Hsp70表达的细胞模型。最后我们对Hsp70高表达和表达抑制的细胞模型进行了鉴定。利用细胞免疫荧光技术和Western-blot技术检测了各细胞中的Hsp70的表达。细胞免疫荧光结果发现A549／quercetin组细胞的荧光强度明显低于正常培养的A549组细胞，而A549／hsp70组细胞的胞浆内荧光较强度明显高于正常培养的A549组细胞，Hsp70水平相对较多；Western-blot检测发现，与A549组相比，A549／quercetin组Hsp70表达明显降低（P＜0.01），A549／hsp70组Hsp70表达明显增加（P＜0.01），A549／DMSO和A549／pcDNA组Hsp70的表达未见明显变化（P＞0.05）。第二部分Hsp70在紫外线致DNA损伤中的作用为阐明紫外线照射不同Hsp70表达后A549细胞DNA损伤的情况，本研究应用MTT试验、彗星试验（单细胞琼脂糖凝胶电泳），检测了紫外线C（UVC）照射不同剂量（10、20、40和80J／m2）对A549、A549／quercetin和A549／hsp70细胞DNA损伤的Olive尾矩。结果表明随着紫外照射剂量的增加，无论在A549组、A549／quercetin组，还是在A549／hsp70组，DNA损伤的Olive尾矩均呈上升趋势。与A549组相比，在UVC照射剂量为10J／m2时A549／DMSO组和A549／pcDNA组Olive尾矩未见明显差异（P＞0.05），A549／quercetin组Olive尾矩明显增加（P＜0.05），A549／hsp70组Olive尾矩明显减少（P＜0.05）；在20J／m2时，A549／quercetin组Olive尾矩明显增加（P＜0.05），A549／hsp70组Olive尾矩明显减少（P＜0.05）；与A549组、A549／DMSO组相比，A549／quercetin组彗星率增加，但差异没有显著性差异（P＞0.05）；但是在40J／m2时，A549／quercetin组Olive尾矩明显增加（P＜0.05），A549／hsp70组Olive尾矩明显减少（P＜0.01）；在80J／m2时，A549／quercetin组Olive尾矩明显增加（P＜0.05），A549／hsp70组Olive尾矩明显减少（P＜0.05）。由此可见，Hsp70参与了UVC造成的DNA损伤过程，它可以对抗一定范围内的UVC造成的的DNA损伤。这可能与作为分子伴侣的Hsp70可以帮助变性受损的蛋白质复性或降解有关，高表达Hsp70充分发挥分子伴侣作用，保持细胞内稳态，减轻细胞的损伤。第三部分Hsp70在紫外线致主要核苷酸切除修复酶mRNA变化中的作用为了进一步探讨Hsp70在DNA修复过程中的作用，利用实时定量RT-PCR技术检测了UVC照射不同剂量（10、20、40和80 J／m2）对A549、A549／quercetin和A549／hsp70细胞中核苷酸切除修复途径上DNA修复酶XPA、XPC、XPB、XPF、XPG和ERCC1基因mRNA的表达，同时观察了Hsp70蛋白水平和DNA核苷酸切除修复酶mRNA表达的相关关系。结果显示：XPA mRNA结果显示：随紫外线照射剂量增加，与未处理组细胞相比，XPAmRNA表达呈升高趋势。以不同细胞分组，与未处理组相比，A549组在10 J／m2时未见明显变化，20 J／m2、40J／m2和80 J／m2时，分别升高至1.7、5.26和6.06倍；A549／DMSO组、A549／pcDNA组和A549／quercetin组与A549组XPA mRNA表达的变化趋势一致：而A549／hsp70组在≤40 J／m2时未见明显变化，到80 J／m2时，XPA mRNA表达升高，相当于A549细胞未处理组的7.1倍。在同一剂量下，XPA mRNA表达与A549组相比，0 J／m2、10 J／m2及80 J／m2时，各细胞组之间无显著性差异（P＞0.05）；A549／hsp70组在20 J／m2时XPA表达降低，但未见显著性差异增加（P＞0.05），40 J／m2时显著降低（P＜0.05）。XPC mRNA结果显示：紫外线照射处理后，各细胞组与未处理A549组细胞相比，XPC mRNA的表达均降低。在A549细胞组，从10 J／m2时开始降低，到80 J／m2时分别降低到0.16、0.25、0.46和0.69倍。A549／DMSO组和A549／pcDNA组XPCmRNA表达变化规律与A549组细胞一致。在A549／quercetin组，从10 J／m2时降低，到80 J／m2时分别降低到0.52、0.52、0.31和0.34倍。在A549／hsp70组，从10 J／m2、20 J／m2和80 J／m2时分别降低为0.39、0.74和0.89倍。在同一剂量下，XPC mRNA表达与A549组相比，0 J／m2时，A549／quercetin组和A549／hsp70组随有升高，但未见显著性差异（P＞0.05）；在10 J／m2时，A549／DMSO组、A549／pcDNA组和A549／hsp70组之间无显著性差异（P＞0.05），A549／quercetin组、A549／hsp70组表达升高但未见显著性差异（P＞0.05），A549／hsp70组在20 J／m2表达升高但未见显著性差异（P＞0.05）；在40 J／m2时，A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.01），与A549／quercetin组相比，A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.01）；在80 J／m2时，A549／quercetin组表达降低、A549／hsp70组表达升高未见显著性差异（P＞0.05）。XPB mRNA结果显示：随紫外线照射剂量增加，与未处理组细胞相比，XPBmRNA表达变化，在A549组，10 J／m2时开始降低为0.85倍，到20 J／m2、40 J／m2和80 J／m2时，分别降低为0.33、0.33和0.34倍；A549／DMSO组和A549／pcDNA组与A549组XPB mRNA表达的变化与A549组一致；A549／quercetin组在10 J／m2时升高为5.74倍，20 J／m2时升高为1.25倍，40 J／m2和80 J／m2分别升高2.43和29倍；在A549／hsp70组，10 J／m2时开始降低，为未处理组的0.35倍，在20 J／m2、40 J／m2和80 J／m2时分别为未处理组的0.6、0.52和0.51倍。在同一剂量下，XPBmRNA表达与A549组相比，0 J／m2时，各细胞组之间无显著性差异（P＞0.05）；在10 J／m2时，与A549组相比，A549／DMSO组和A549／pcDNA组之间无显著性差异（P＞0.05），A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01），与A549／hsp70组相比表达明显升高（P＜0.01）；在20 J／m2时，与A549组相比，A549／DMSO组和A549／pcDNA组之间无显著性差异（P＞0.05），A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01），与A549／hsp70组相比，A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01）；在40 J／m2时，与A549组相比，A549／DMSO组和A549／pcDNA组之间无显著性差异（P＞0.05），A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01），与A549／hsp70组相比，A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01）；在80 J／m2时，与A549组相比，A549／DMSO组和A549／pcDNA组之间无显著性差异（P＞0.05），A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01），与A549／hsp70组相比，A549／quercetin组表达明显升高（P＜0.01）。XPF mRNA结果显示：随紫外线照射剂量增加，除A549／hsp70组外，其它各细胞组XPF mRNA表达均降低。在A549组，从10 J／m2到80 J／m2分别降低为0.6、0.51、0.46和0.57倍；A549／DMSO组和A549／pcDNA组与A549组XPF mRNA表达的变化与A549组基本一致；A549／quercetin组从10 J／m2到80 J／m2分别降低为0.48、0.31、0.16和0.63倍；A549／hsp70组，XPF mRNA表达在10 J／m2时开始降低为0.6倍，然后又逐步开始升高，在40 J／m2和80 J／m2时分别为A549未处理组的1.63和1.75倍。在同一剂量下，XPF mRNA表达与A549组相比，0 J／m2、10 J／m2和20 J／m2时，各细胞组之间无显著性差异（P＞0.05）；在40 J／m2时，与A549组相比，A549／quercetin组表达降低，但无显著性差异（P＞0.05），A549／hsp70组明显增高（P＜0.01），与A549／quercetin组相比，A549／hsp70组表达明显降低（P＜0.01）；在80 J／m2时，与A549组相比，A549／quercetin组表达降低但无显著性差异（P＞0.05），A549／hsp70组明显增高（P＜0.01），与A549／quercetin组相比，A549／hsp70组表达明显降低（P＜0.01）。XPG mRNA结果显示：在紫外线照射的各剂量组，与未处理组细胞相比，除A549／hsp70组，其它各组XPG mRNA表达均降低。在A549组，10 J／m2时开始降低，为未处理组的0.38倍，20 J／m2、40 J／m2、80 J／m2时分别为未处理组的0.32、0.65和0.74倍；A549／DMSO组和A549／pcDNA组与A549组XPG mRNA表达的变化与A549组一致；A549／quercetin组在10 J／m2时开始降低，为未处理组的0.5倍，20 J／m2、40 J／m2、80 J／m2时分别为未处理组的0.97、0.67和0.89倍；在A549／hsp70组，从10 J／m2时开始升高，为未处理组的1.28倍，20 J／m2时又降低为未处理组的0.69倍，在40 J／m2和80 J／m2时又升高，分别为为未处理组的1.41和1.81倍。在同一剂量下，XPG mRNA表达与A549组相比，0 J／m2时，各细胞组之间无显著性差异（P＞0.05）；在10 J／m2时，A549／DMSO组、A549／pcDNA组和A549／quercetin组之间无显著性差异（P＞0.05），A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.05），与A549／quercetin组相比，A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.05）；在20 J／m2时，各组间未见显著性差异（P＞0.05）；在40 J／m2和80 J／m2时，A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.05），与A549／quercetin组相比，A549／hsp7D组表达明显升高（P＜0.05）。ERCC1 mRNA结果显示：随紫外线照射剂量增加，与未处理组细胞相比，ERCC1 mRNA表达变化呈降低趋势；在A549组，从10 J／m2到80 J／m2分别降低为0.35、0.47、0.52和0.57倍；A549／DMSO组和A549／pcDNA组与A549组ERCC1 mRNA表达的变化与A549组一致；A549／quercetin组从10 J／m2到80 J／m2分别降低为0.28、0.38、0.39和0.48倍；在A549／hsp70组，从10 J／m2到80 J／m2分别降低为0.68、0.51、0.69和0.86倍。在同一剂量下，ERCC1 mRNA表达与A549组相比，0 J／m2时，各细胞组之间无显著性差异（P＞0.05）；在10 J／m2时，A549／DMSO组和A549／pcDNA组无显著性差异（P＞0.05），A549／quercetin组虽然降低但无显著性差异（P＞0.05），A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.05），与A549／quercetin组相比，A549／hsp70组表达明显升高（P＜0.01）；在20 J／m2、40 J／m2和80 J／m2时，A549／quercetin组均降低但无显著性差异（P＞0.05），A549／hsp70组均升高但无显著性差异（P＞0.05）。另外，我们通过瞬时转染含虫荧光素酶报告基因的pCMVluc质粒，40h后检测宿主细胞对损伤质粒DNA的修复情况，根据宿主细胞表达荧光物质的含量来评估宿主细胞的DNA整体修复能力，为人群流行病学检测大样本的DNA修复能力提供一些实验依据。综上所述，本研究结果表明：（1）确定了槲皮素抑制A549细胞Hsp70表达的最佳剂量，150μmol／L的槲皮素可以有效抑制A549细胞Hsp70表达；采用含hsp70基因cDNA重组质粒进行细胞转染并经筛选建立了稳定的Hsp70过表达细胞株。（2）初步筛选了RNAi抑制Hsp70的有效序列（5’-CTT ATG AAC CAC TTTGAT TTG C-3’）。（3）Hsp70可以减轻紫外线C中低剂量（≤40J／m2）引起的A549细胞DNA损伤。（4）紫外线C照射Hsp70表达抑制和Hsp70过表达细胞后的核苷酸切除修复过程中的DNA修复基因mRNA表达变化为：XPA表达在紫外线照射40J／m2时，A549／hsp70组表达明显降低而A549／quercetin组未见明显降低：XPC表达在20J／m2和40 J／m2时紫外线照射时，A549／hsp70组明显升高，而A549／quercetin组未见变化；XPB表达在紫外线照射的各剂量组，A549／quercetin组明显升高，A549／hsp70组与A549组相比未见显著性差异；XPF在紫外线照射的高剂量时，A549／hsp70组表达明显升高；XPG在紫外线照射的高剂量时，A549／hsp70组表达明显升高；ERCC1在紫外线照射低剂量时，A549／hsp70组表达明显升高。（5）UVC照射下，Hsp70蛋白与DNA核苷酸切除修复酶基因XPA、XPB、XPF、XPG、ERCC1 mRNA表达之间存在相关关系，而Hsp70蛋白与XPC mRNA表达之间未发现相关关系。本研究的创新之处在于：（1）同时使用了Hsp70升高和降低的细胞模型，为探讨Hsp70的功能提供有力的依据，可以从正反两个方面同时验证Hsp70的功能和作用；（2）同时考虑到了Hsp70在DNA的损伤和修复过程中的作用，而不是单纯的损伤或修复。本课题有待深入研究的方面有：（1）关于Hsp70表达抑制的模型，应该进一步用特异性的手段。针对RNAi技术存在的一些问题加以改进，比如继续筛选更加有效的siRNA序列、通过稳定转染筛选低Hsp70表达稳定的细胞株来进行实验；（2）Hsp70与DNA修复的关系还有待于进一步的研究和探索，尤其是Hsp70参与DNA修复的具体机制还有待于证实；（3）可以通过激光共聚焦、染色质免疫沉淀等方法来检测Hsp70蛋白与DNA修复酶之间的交互作用；（4）DNA整体修复能力的测定如何应用于人群现场流行病学调查，如何应用于职业性有害因素对机体DNA损伤修复的评价，还需要进一步的探讨。

论文目录

• 英文缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 Hsp70过表达及Hsp70表达抑制细胞模型的建立
• Ⅰ Hsp70过表达的体外研究
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• Ⅱ 槲皮素抑制Hsp70表达的体外研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• Ⅲ 应用RNA干扰抑制Hsp70表达的体外研究
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• Ⅳ Hsp70表达的鉴定
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第二部分 Hsp70在紫外线致DNA损伤中的作用
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 Hsp70在紫外线致主要核苷酸切除修复酶mRNA变化中的作用
• Ⅰ Hsp70在紫外线致核苷酸切除修复酶mRNA变化中的作用
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• Ⅱ 宿主细胞复活试验检测DNA修复能力方法的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述:RNA干扰研究进展及其在职业医学领域的应用前景
• 博士研究生期间工作小结
• 致谢