大黄酚对黄瓜白粉病菌的抑制作用机制研究

论文摘要

黄瓜白粉病是由Sphaerotheca fuliginea Poll.引起的一种潜育期短、再侵染频繁、流行性强的叶部病害。目前使用杀菌剂和抗病品种是防治白粉病的重要手段。但随着药剂的大量和长时间使用,各地病原菌对一些药剂产生了不同程度的抗性,防效大幅度降低。因此,开发对瓜类白粉病高效、低毒、低残留的新型杀菌剂是当前研究的一个热点。本论文以游离蒽醌类(Anthraquinone)化合物大黄酚(Chrysophanol)为材料,采用室内外生物测定相结合的方法,首先建立了黄瓜白粉病生物测定体系,并研究了大黄酚对黄瓜白粉病菌的保护和治疗生物活性及作用方式;同时对大黄酚进行了剂型加工和田间试验。随后又从组织病理学和超微结构方面研究了大黄酚对黄瓜白粉病菌的作用机制。此外,还研究了大黄酚对黄瓜白粉病菌孢子呼吸代谢的影响,以及寄主体内与植物抗病相关酶基因变化规律。本研究取得了以下主要结果:1.建立了以下针对黄瓜白粉病菌的简便、快速的杀菌剂生测体系:选用对白粉病菌高度感病黄瓜品种新长春密刺,苗龄为5~10 d,菌龄10~15 d,接种浓度为30~40个孢子/视野(10×10倍显微镜)的悬浮液,采用子叶喷雾法或叶盘法进行生物测定,曲利苯兰染色后对白粉病菌的整个生长发育阶段进行组织学观察。2.应用子叶喷雾法测试了大黄酚及2种化学药剂对黄瓜白粉病菌(S. fuliginea)的保护和治疗生物活性。结果表明,大黄酚能有效降低黄瓜白粉病的病情指数,其保护和治疗作用的EC50分别为33.36μg/mL和90.10μg/mL,对照药剂硫磺悬浮剂保护作用的EC50为59.75μg/mL,苯醚甲环唑可湿性水分散粒剂治疗作用的EC50为13.55μg/mL。3.采用喷雾法分别在黄瓜子叶期和真叶期研究了大黄酚对黄瓜白粉病菌的作用方式及其在寄主组织中的内吸传导性。大黄酚对黄瓜的保护作用具有较长的持效期,在100μg/mL浓度下施药20 d后接种白粉病菌,其防效仍达84.83%,与浓度为500μg/mL的硫磺悬浮剂防效相近。大黄酚在寄主组织中有一定的跨层传导性,横向传导性较弱,几乎没有表现出向顶及向基的传导性。4.将含有47%的大黄酚经剂型加工得到了5%大黄酚悬浮剂,经室内和田间测定,其加工后的悬浮剂对黄瓜白粉病菌的防效优异。在田间69 g (a.i)/hm2的使用剂量下防效达到88.9%。5.从组织病理学角度揭示了大黄酚对白粉病菌的整个生长发育阶段进的影响。结果发现,2.4μg/mL大黄酚可有效降低黄瓜白粉病菌分生孢子的萌发率和萌发芽管个数,能抑制菌丝的生长并减少新生分生孢子的个数。接种后24 h,清水对照萌发率为66.6%,而大黄酚处理后的孢子不萌发;接种后48 h,对照菌丝的平均长度为414.7μm,大黄酚处理的菌丝平均长度为40.1μm;接种后144 h,对照的新生分生孢子串最多为8个孢子,大部分为6~7个,而大黄酚处理后新生分生孢子串最多为2个孢子,大部分为1个。接种7 d后对照的病情指数为72.2,大黄酚处理组的病情指数仅为2.1,其保护作用防治效果达到97.1%,显著高于50%硫磺悬浮剂65.4%的防效。6.电镜观察发现大黄酚作为保护剂使用时,黄瓜白粉病菌的大部分孢子细胞壁破裂不能萌发侵入寄主,部分分生孢子的萌发受到明显抑制,芽管或菌丝表现畸形,孢子表现皱缩、萌发侵入缓慢。侵染钉被致密乳突包围,少数侵染钉能突破乳突产生畸形的吸器,吸器内原生质电子致密度加深,原生质凝集,吸器中的细胞器逐渐解体成为泡囊,表明吸器即将解体。大黄酚作为治疗剂使用后,白粉病菌大部分萌发的芽管和附着胞畸形或破裂,菌丝顶端肿胀,部分菌丝塌陷、扭曲或断裂、停止发育。大黄酚处理后寄主产生的乳突增多,且结构致密,寄主细胞壁不规则加厚,染色加深,在寄主细胞壁与质膜之间可以观察到电子致密度加深的颗粒状木栓化物质沉积,产生的吸器被乳突包围,败育;即使有吸器生成,在形态上也发生了明显的变化,吸器明显畸形;吸器内原生质电子致密度加深,吸器外质膜加厚,染色明显加深,吸器产生空腔,液泡增大;一些吸器外基质加宽,吸器内细胞器解体,有逐渐畸形坏死的趋势。大黄酚作为铲除剂使用时,大黄酚处理后的黄瓜白粉病菌的分生孢子和菌丝扭曲、变形和塌陷。7.通过测定黄瓜白粉病菌分生孢子悬浮液加入大黄酚后其呼吸速率和抑制率的变化发现,大黄酚对呼吸的磷酸戊糖途径具有抑制作用,大黄酚与磷酸钠的叠加率为10%8.通过对喷施大黄酚后黄瓜叶片内的抗病相关酶活性的测定发现,施药后挑战接种白粉病菌,PAL、叶绿素、木质素和总酚含量增加,CAT、PPO、POD活性和类黄酮含量没有明显变化。PAL活性在接种后持续增加,并分别在接种后第2和7 d达到第一个和第二个峰值。在第7 d时酶活性约是丙酮接种对照组的4.9倍,而大黄酚处理后不接种的处理酶活性偏低。大黄酚处理后,无论是否接种,叶片叶绿素含量都上升,在接种后第3 d叶绿素含量是丙酮对照的1.8倍。施药后无论是否接种白粉病菌,木质素含量在接种后2 d达到第一个峰值,其中接种的处理木质素含量是起初的4.9倍,不接种的处理木质素含量是起初的6.8倍,而丙酮溶液处理对照的木质素含量表现的比较稳定。大黄酚处理诱导提高了总酚的含量,施用大黄酚后接种黄瓜叶片苯总酚的含量分别于接种后1 d和5 d出现高峰,比丙酮接种对照组分别高出36%和23%。9.通过实时荧光定量,检测到施用大黄酚后黄瓜植株的抗性相关酶的变化,PAL和chitinase基因能够被诱导表达。在大黄酚处理接种后,PAL基因在接种后1 d表达量增高,接种后2 d PAL基因上调达到高峰,为起初的9.5倍;实时荧光定量技术测得的基因表达结果分析显示,经大黄酚处理后chitinase基因在接种后1 d出现表达高峰,为最初的3.8倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1. 黄瓜白粉病研究概况
• 1.1 黄瓜白粉病的发生症状及病原研究
• 1.2 黄瓜白粉病的防治现状
• 2. 植物源杀菌剂的研究现状
• 3 杀菌剂对植物病原菌作用机制的研究
• 3.1 电子显微镜在植物病原真菌中的应用
• 3.2 杀菌剂对白粉病菌及植物与白粉菌互作的超微结构的影响
• 4 农药悬浮剂的概述
• 4.1 农药悬浮剂的概念
• 4.2 农药悬浮剂的研究现状
• 5 荧光定量PCR 技术在植物及其病害上的应用
• 5.1 实时荧光定量PCR 分析技术
• 5.2 荧光定量PCR 技术在植物病害上的应用
• 6 研究的目的和意义
• 第一章 黄瓜白粉病生物测定体系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同品种感病性比较
• 2.2 分散剂浓度的确定
• 2.3 孢子悬浮液浓度的确立
• 2.4 不同接种时间孢子对白粉病发病的影响
• 2.5 不同苗龄感病性
• 2.6 接种方法
• 2.7 染色方法比较
• 2.8 生测方法比较
• 3 讨论
• 第二章 大黄酚对黄瓜白粉病菌的作用方式初探
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 大黄酚对黄瓜白粉病的保护及治疗作用测试
• 2.2 持效期
• 2.3 内吸传导
• 3 讨论
• 第三章 大黄酚悬浮剂研制和田间试验
• 第一节 5%大黄酚水悬浮剂的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 配方筛选
• 1.3 理化性能指标的测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 润湿分散剂的选择
• 2.2 增稠剂的选择
• 2.3 防冻剂的选择
• 2.4 消泡剂的选择
• 2.5 保护剂和还原剂的选择
• 2.6 最佳配方及其技术指标
• 2.7 大黄酚质量分数的测定
• 第二节 5%大黄酚悬浮剂防治黄瓜白粉病药效试验
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 室内生物测定
• 2.2 5%大黄酚悬浮剂对黄瓜白粉病菌田间防治试验
• 3 讨论
• 第四章 大黄酚对黄瓜白粉病菌的抑制作用研究
• 第一节 大黄酚对黄瓜白粉病菌孢子呼吸代谢的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 大黄酚对黄瓜白粉病菌呼吸代谢的影响
• 第二节 大黄酚对黄瓜白粉病菌抑制作用的显微观察
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大黄酚对黄瓜白粉病菌分生孢子萌发、菌丝生长和孢子形成的影响
• 2.2 病情调查
• 第三节 大黄酚对黄瓜白粉病菌抑制作用的超微观察
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 利用扫描电镜观察经大黄酚处理后黄瓜白粉菌的超微结构变化特征
• 2.2 利用透射电镜观察经大黄酚处理后黄瓜白粉病菌以及寄主细胞超微结构变化特征
• 3 讨论
• 第五章 大黄酚对黄瓜叶片中相关酶活性和基因转录的影响
• 第一节 大黄酚对黄瓜叶片中相关酶活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定结果
• 2.2 过氧化氢酶（CAT）活性的测定结果
• 2.3 多酚氧化酶（PPO）含量测定结果
• 2.4 过氧化物酶（POD）活性测定结果
• 2.5 黄瓜叶片叶绿素含量测定结果
• 2.6 黄瓜叶片总酚含量测定结果
• 2.7 黄瓜叶片类黄酮含量测定结果
• 2.8 木质素含量的测定结果
• 第二节 大黄酚对黄瓜叶片内相关酶基因转录的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 提取质量控制
• 2.2 黄瓜几种抗性相关酶基因的引物验证
• 2.3 目的基因的荧光定量PCR
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢