抗虫/耐草甘膦多价转基因玉米的研究

论文摘要

玉米是大宗粮食作物,又是重要的饲料和工业原料,由于虫害和草害的威胁,导致其产量和质量严重下降。基因工程的诞生为玉米虫害和草害的防治提供了有效手段。G2-epsps基因是从草甘膦长期污染的极端环境中分离的荧光假单胞菌（psedomonas fluorescens G2）中克隆的新基因,具有自主知识产权。为提高耐草甘膦基因G2-epsps在转基因玉米中的表达水平,首先对基因进行了植物密码子优化,改造后的基因命名为2mG2-epsps基因,优化后基因的G+C含量由原来的58%调整到了53%,与G2-epsps基因核苷酸序列相似性为89%。为使该草甘膦抗性基因编码产物正确定位于叶绿体,克隆了拟南芥的EPSPS酶的叶绿体转运肽序列,大小为244bp,测序结果表明该序列与已知序列的相似性为100%。Bt cry1Ah基因是从我国自行分离的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株BT8中克隆的新型杀虫蛋白基因,cry1Ah基因的编码产物对鳞翅目害虫的杀虫活性强于目前使用的cry1Ac或者cry1Ab基因。cry1Ie基因是本研究组克隆的另一个具有自主知识产权的Bt杀虫基因,其编码蛋白对敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。cry1Ie与cry1Ab和cry1Ac无交互抗性,将cry1Ah和cry1Ie构建到同一表达载体中,能够更为有效地克服现有Bt基因同源性高、种类单一、昆虫对Bt蛋白产生抗性等问题,同时可望获得抗虫性更好的转基因植物。本研究利用抗虫基因cry1Ah和耐草甘膦基因2mG2-epsps构建了双价植物表达载体,通过基因枪轰击转化玉米,以2mG2-epsps为筛选标记基因,以草甘膦异丙胺盐作为筛选剂,获得到了抗性较好的T0代转化植株80株。通过对T0、T1、T2代转基因植株的分子检测、抗虫生物活性检测、田间草甘膦抗性检测表明,共获得了5个能够稳定遗传具有抗虫性和草甘膦耐受性的转基因玉米品系。同时构建了含有Bt cry1Ah和cry1Ie基因和耐草甘膦2mG2-epsps基因的三价植物表达载体,通过基因枪轰击法转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps为筛选标记基因,以草甘膦异丙胺盐作为筛选剂,获得T0代转化植株69株,PCR检测结果表明:有17株已完整的整合有抗虫基因cry1Ah、cry1Ie和耐草甘膦基因2mG2-epsps的3个目的基因,RT-PCR分析外源基因可以正确转录,已获得结实转基因植株。三价转基因玉米的获得为我国多基因双抗性转基因玉米的研究打下了基础,为下一步的玉米育种提供了材料。实验中以2mG2-epsps基因作为筛选标记基因,为确定其筛选时间及筛选压力,进行了玉米愈伤组织对不同浓度草甘膦的抗性实验,确定向培养基中添加浓度为1mM的草甘膦异丙胺盐筛选15天能有效的抑制非转基因玉米愈伤组织的分化,本研究的再生植株的阳性率为45%,为玉米及其它单子叶作物转化提供了一种有效、安全的筛选体系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 Bt 抗虫基因及其转基因植物的研究进展
• 1.1.1 Bt 杀虫蛋白基因
• 1.1.2 Bt 杀虫蛋白基因分类
• 1.1.3 Bt 杀虫蛋白的杀虫机理
• 1.1.4 转Bt 基因植物研究进展
• 1.1.5 昆虫对Bt 蛋白产生抗性问题及预防对策
• 1.2 草甘膦及转EPSPS 基因耐草甘膦植物研究进展
• 1.2.1 草甘膦除草剂
• 1.2.2 EPSP 合酶研究进展
• 1.3 抗虫/耐草甘膦转基因玉米安全性评价
• 1.4 外源基因在转基因植物中高效表达的方法和策略
• 1.4.1 启动子
• 1.4.2 内含子
• 1.4.3 核基质附着区MARs 序列的应用
• 1.4.4 基因改造
• 1.4.5 5’-UTR 和3’-UTR 的应用
• 1.4.6 定位信号肽的利用
• 1.4.7 多基因策略
• 1.4.8 叶绿体转化
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 宿主菌
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 各种酶及试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 实验过程中所用PCR 引物
• 2.1.6 实验所用质粒
• 2.2 常用培养基和溶液的配制
• 2.2.1 培养基配制
• 2.2.2 溶液的配制
• 2.3 实验所需试剂配制
• 2.3.1 质粒DNA 的提取
• 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.3 幼胚的剥离
• 2.3.4 基因枪转化
• 2.3.5 基因组DNA 提取缓冲液
• 2.3.6 ELISA 分析
• 2.3.7 Southern 杂交分析
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.2 对大肠杆菌的转化
• 2.4.3 琼脂糖凝胶中DNA 片段的回收
• 2.4.4 DNA 克隆
• 2.4.5 碱裂解法少量提取质粒DNA
• 2.4.6 用QIAGEN-tip100 试剂盒大量提取质粒
• 2.4.7 玉米的控制授粉
• 2.4.8 幼胚的剥离和培养
• 2.4.9 基因枪微弹的准备
• 2.4.10 用基因枪进行玉米转化
• 2.4.11 玉米愈伤草甘膦筛选压确立实验
• 2.4.12 转化愈伤组织的筛选和植株的再生
• 2.4.13 植物组织基因组DNA 的提取
• 2.4.14 基因组DNA 的PCR 扩增
• 2.4.15 Southern 杂交分析
• 2.4.16 植物总RNA 的提取
• 2.4.17 RT-PCR 分析
• 2.4.18 ELISA 分析
• 2.4.19 蛋白含量的测定
• 2.4.20 转基因玉米的抗虫性测定
• 2.4.21 转基因玉米草甘膦抗性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 G2-epsps 基因改造
• 3.2 克隆拟南芥EPSPS 转运肽（CTP）序列
• 3.3 植物表达载体的构建
• 3.3.1 中间载体p7MNM，pU2mG2，pA2mG2 的构建
• 3.3.2 植物表达载体pMAGUHM，pMAEAGUH 的构建
• 3.4 玉米愈伤草甘膦筛选压确立实验
• 3.4.1 不同草甘膦浓度对玉米愈伤组织生长的影响
• 3.4.2 不同筛选时间对玉米愈伤组织生长的影响
• 3.5 基因枪轰击转化玉米胚性愈伤组织
• 3.6 cry1Ah 和2mG2-epsps 在转基因玉米中的表达
• 3.6.1 T0 代转基因植株的PCR 检测
• 3.6.2 TI 代转基因植株的检测
• 3.6.3 T2 代转基因植株的检测
• 3.7 转cry1Ah、cry11e 和2mG2-epsps 三基因玉米植株的获得
• 3.7.1 T0 代转基因植株的PCR 检测
• 3.7.2 T0 代转基因植株的RT-PCR 分析
• 3.7.3 T0 代转基因植株的结实情况
• 4 讨论
• 4.1 基因改造在转基因植物中的应用
• 4.2 2mG2-epsps 基因作为筛选标记基因在转基因植物中应用
• 4.3 植物高效表达载体构建分析
• 4.4 抗虫/耐草甘膦基因在转基因玉米中的表达分析
• 4.5 基因枪转化法在植物遗传转化中的应用
• 4.6 下一步工作展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文