基于转录机器扰动的迟钝爱德华氏菌毒力相关基因鉴定

论文摘要

许多病原微生物的σE因子做为整个毒力调控网络的最上层发挥着重要作用,为了对迟钝爱德华氏菌毒力相关基因进行筛查鉴定,本课题通过对σE因子过量表达来实现全局转录扰动,试图在这种动态变化中发现毒力相关基因。首先,构建rpoE过量表达株,并对模式鱼进行感染,结果发现与对照株相比过量表达株毒力有所增强,但增加幅度较小。通过对过量表达株进行环境压力耐受性实验,发现其与对照株相比没有明显变化。而利用实时荧光定量PCR技术发现了degP等5个受rpoE调控的基因,这5个基因在转录水平上均有一定的上调,说明过量表达rpoE已经对迟钝爱德华氏菌的转录过程成功实施了扰动,但根据压力耐受性实验和模式鱼的感染实验又发现rpoE的过量表达没有对迟钝爱德华氏菌的生理生化性质发生较大改变,推测由于rpoE只调控部分基因的表达,而细菌的整个基因调控网络非常的复杂,这种复杂性可能会对细菌所处的内外环境的改变起到某种缓冲作用,使得基因转录水平的局部扰动并不能够在生理生化水平上有较大的变化,这可能也是细菌为了适应复杂的内外界环境长期进化的结果。对以上5个基因启动子区域的分析发现这些启动子具有一定的相似性,说明迟钝爱德华氏菌rpoE所识别的启动子具有特异性。通过在计算机水平上进行全基因组预测,发现了86个转录单元可能受rpoE的转录调控。本课题前期拟通过对rpoE基因全敲除的方式来实现转录水平的扰动,但一直没有成功将基因敲除。分析原因可能是由于迟钝爱德华氏菌与大肠杆菌都属于肠杆菌属,而在大肠杆菌中rpoE是生理生化必需基因。另外,在2010年最新发表的对迟钝爱德华氏菌degP基因相关研究的文章中,作者也提到未能成功敲除degP基因,而degP基因是受rpoE调控的基因。还有在2008年发表的对Tkodakarensis sigma因子的相关研究中,发现rpoE基因也未能被成功敲除。根据本课题的实验结果和以上文献的相关报道可以初步推测迟钝爱德华氏菌EIB202的rpoE基因是不可敲除的,该基因是生理生化必需基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 综述与导言
• 1.1 水产养殖现状
• 1.2 减毒疫苗开发对防治养殖型病原菌感染的重要意义
• 1.3 迟钝爱德华氏菌介绍
• 1.3.1 分类命名
• 1.3.2 生物学特性
• 1.3.3 迟钝爱德华氏菌的感染
• 1.3.4 微生物学检验
• 1.4 爱德华氏菌致病机理的研究概况
• 1.5 相关实验技术
• 1.5.1 RNA逆转录
• 1.5.2 实时荧光定量PCR
• 1.5.3 自杀质粒敲除系统
• 1.6 课题研究背景
• 1.7 工作目标
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 化学药品与生物试剂
• 2.1.2 细菌培养基
• 2.1.3 缓冲液
• 2.1.4 实验仪器与设备
• 2.1.5 菌种
• 2.1.6 载体质粒
• 2.1.7 重组质粒
• 2.1.8 实验用到的引物
• 2.2 微生物学方法
• 2.2.1 细菌培养条件
• 2.2.2 菌种的保藏
• 2.3 遗传学方法
• 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.2 大肠杆菌的转化
• 2.3.3 迟钝爱德华氏菌电转感受态细胞的制备
• 2.3.4 迟钝爱德华氏菌迟钝爱德华氏菌电击转化
• 2.4 分子生物学方法
• 2.4.1 大肠杆菌中质粒DNA的抽提
• 2.4.2 DNA的酶切
• 2.4.3 DNA的连接
• 2.4.4 DNA的沉淀
• 2.4.5 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.6 DNA的琼脂糖凝胶回收
• 2.4.7 细菌中的总RNA提取
• 2.4.8 RNA纯度检测—分光光度计法
• 2.4.9 RNA的逆转录
• 2.4.10 实时荧光定量PCR
• 2.5 实验过程中使用的生物学软件
• 第3章 结果与分析
• 3.1 通过构建rpoE过量表达株对转录机器进行扰动
• 3.1.1 巨型质粒与E.tarda毒力之间的关系不明显
• 3.1.2 rpoE过量表达株的构建
• 3.1.3 实时荧光定量PCR分析过量表达株的相对表达量
• 50)的测定'>3.1.4 对模式生物斑马鱼的感染及半数致死剂量(LD₅₀)的测定
• 3.1.5 压力耐受性实验
• 3.1.6 实时荧光定量PCR
• E识别调控的相关基因'>3.2 通过软件预测σ^E识别调控的相关基因
• E识别的启动子序列查找'>3.2.1 迟钝爱德华氏菌EIB202 σ^E识别的启动子序列查找
• 3.2.2 启动子区域的sequence logos
• E调控基因计算机分析预测'>3.2.3 σ^E调控基因计算机分析预测
• 3.3 迟钝爱德华氏菌rpoE基因的敲除
• 3.3.1 rpoE自杀灭活质粒pRE112-△rpoE的构建
• 3.3.2 pRE112-derpoE转化SM10λpir并酶切鉴定
• 3.3.3 利用自杀灭活质粒pRE112-△rpoE敲除染色体上的rpoE
• 第4章 讨论
• 第5章 结论及展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢