介导神经递质释放的SNARE复合体调控神经递质γ-氨基丁酸重摄取的机制研究

论文摘要

神经递质释放到突触间隙是由SNARE（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor proteins）复合体的形成介导的。该复合体由两个位于细胞质膜上的定向SNARE蛋白（target-SNARE）syntaxin 1A和SNAP-25,以及一个位于囊泡膜上的囊泡SNARE蛋白（vesicle-SNARE）VAMP-2三者组成。定向SNARE蛋白syntaxin 1A和SNAP-25首先形成一个中间复合体,被称为定向SNARE复合体（target-SNARE complex）,待VAMP-2结合上来进一步形成SNARE复合体（SNARE complex）。抑制性神经递质γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）也是通过以上过程被释放到突触间隙,与突触后膜的GABA受体结合,向突触后传递信号,GABA转运蛋白（GABA transporter）会重摄取突触间隙中的GABA以终止突触的信号传递。已有研究表明定向SNARE蛋白syntaxin 1A可以与位于神经元上的GABA转运蛋白GAT-1（GABA transporter-1）亚型直接结合,从而抑制它的重摄取功能,然而其它的SNARE蛋白或者SNARE复合体能否调节GABA的重摄取还没有相关的报道。本文运用分子克隆、细胞GABA摄取检测、免疫细胞化学、免疫共沉淀和荧光共振能量转移测定等方法,研究了SNARE复合体对GAT-1的调控机制。研究结果表明:在syntaxin 1A存在的情况下SNAP-25能够有效抑制GAT-1的重摄取功能,这种抑制依赖于SNAP-25/syntaxin 1A复合体即定向SNARE复合体的形成。Syntaxin 1A的H3结构域被鉴定为结合SNAP-25和GAT-1的位点。SNAP-25与syntaxin 1A结合加强了syntaxin 1A与GAT-1的相互作用,从而显著增强了syntaxin 1A介导的对GAT-1重摄取功能的抑制。同时,我们发现囊泡SNARE蛋白VAMP-2与定向SNARE复合体的结合不影响后者对GAT-1的调控作用。进一步的研究还发现一氧化氮（NO）促进的syntaxin 1A与SNAP-25结合以及SNARE复合体形成能够加强syntaxin 1A与GAT-1的相互作用,从而抑制GAT-1对GABA的重摄取。以上这些结果为定向SNARE复合体对GABA转运蛋白的调节提供了分子机制,同时提示GABA的释放和重摄取之间存在直接的反馈调节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 质粒的构建
• 2.2 海马原代神经元细胞培养及转染
• 2.3 PC12细胞和HEK293细胞的培养和转染
• 2.4 细胞摄取功能测定
• 2.5 生物素标记和蛋白免疫杂交
• 2.6 免疫细胞化学实验
• 2.7 免疫共沉淀和免疫印记
• 2.8 荧光共振能量转移测定
• 2.9 数据分析
• 3. 实验结果
• 3.1 SNAP-25 和syntaxin 1A 参与抑制GAT-1 的功能
• 3.2 SNAP-25 加强syntaxin 1A 介导的对GAT-1 功能的抑制
• 3.3 SNAP-25 和GAT-1 的相互作用依赖于syntaxin 1A
• 3.4 SNAP-25上调GAT-1和syntaxin 1A在细胞膜表面的表达量
• 3.5 SNA-25 加强syntaxin 1A 和GAT-1 的相互作用
• 3.6 SNARE 复合体形成抑制GAT-1 功能
• 3.7 SNARE 复合体形成加强syntaxin 1A 和GAT-1 的相互作用
• 4. 讨论
• 4.1 SNARE复合体对GAT-1的调控机制
• 4.2 SNARE复合体对膜蛋白功能进行调控的特异性和广泛性
• 4.3 SNARE复合体对GABA重摄取进行调控的生理学意义
• 5. 参考文献
• 专业综述：γ－氨基丁酸转运蛋白的结构、功能与调控概述
• 缩写词
• 发表文章目录
• 致谢