鸡致病性大肠杆菌FimC基因缺失菌株的构建及其生物学特性的研究

论文摘要

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌(Escherichia colii,E.coli)所引起的局部或全身性感染的疾病。菌体在体内的定居主要是通过粘附因子—菌毛的吸附进行的。鸡源E.coli的菌毛主要分为两种,Ⅰ型菌毛和P菌毛,在鸡源E.coli的致病过程中,普遍认为菌株在呼吸道中定居主要依靠Ⅰ型菌毛,P菌毛则是在菌株进一步致病过程中发挥作用。研究表明,人源大肠杆菌Ⅰ型菌毛是感染粘附的主要因子。其中fimC基因编码的fimC蛋白是Ⅰ型菌毛的主要亚基,介导Ⅰ型菌毛的装配, fimC基因的变异可导致菌毛合成功能的丧失。已从鸡源大肠杆菌得到类似于人源大肠杆菌fimC基因,并与人源大肠杆菌fimC基因具有很高的同源性。为了进一步研究fimC基因在鸡大肠杆菌致病过程中所起的作用,构建了一株E.coli O2 fimC基因缺失突变株。本实验以E.coli O2为亲本菌种,首先用PCR的方法扩增出缺失了171bp的fimC基因片段,将其克隆到自杀性载体pCVD442中,构建了重组质粒pCVD442::△fimC并转化到宿主菌SM10λpir中,然后通过接合性转导的方法将自杀质粒pCVD442::△fimC从SM10λpir转到O2(NalR)中,利用自杀性载体技术,根据同源重组的原理,敲除了基因组上的fimC基因,构建了fimC基因缺失突变菌株O2(△fimC)。通过菌毛的表达实验、与鸡气管上皮的粘附实验和对雏鸡的致病性实验研究了该缺失突变菌株的特性。研究表明,具有致病性的亲本菌株在营养肉汤中37℃培养72h后,能够表达大量的Ⅰ型菌毛,而缺失菌株在相同的条件下则不能产生菌毛。粘附实验结果显示,亲本菌株与气管环37℃共同培养3h后,有大量细菌牢固地粘附于鸡气管粘膜上;而缺失菌株在相同的培养条件下,仅有少数细菌粘附于鸡气管粘膜上,突变菌的粘附能力大约是亲本菌的1/50。对雏鸡的致病性实验表明,该缺失突变菌株相对于亲本菌株毒力明显降低,但仍具有一定程度的致病性,亲本菌与缺失突变菌对雏鸡的致死率分别是6/8和2/8。通过基因敲除构建缺失突变菌株,为研究fimC基因在鸡大肠杆菌致病机理中所起的作用和fimC基因缺失突变株其它生物学功能奠定了重要物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 鸡大肠杆菌病的概述
• 1.1.1 流行特点
• 1.1.2 发病原因
• 1.1.3 临床症状
• 1.1.4 病理变化
• 1.1.5 诊断与预防
• 1.2 大肠杆菌的主要致病因子
• 1.2.1 E.coli 菌毛
• 1.2.2 毒素
• 1.2.3 外膜蛋白及其他致病因素
• 1.3 Ⅰ型菌毛的基因簇结构及其功能
• 1.3.1 亚单位FimA
• 1.3.2 亚单位FimB 和FimE
• 1.3.3 亚单位FimD
• 1.3.4 亚单位FimF、FimG、FimH
• 1.3.5 亚单位FimI
• 1.3.6 FimC 的研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 酶类及主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 PCR 扩增引物
• 2.2 实验方法
• 2基因组DNA 的提取'>2.2.1 大肠杆菌O₂基因组DNA 的提取
• 2.2.2 E.coli 02 fimC 基因及其左右翼序列的鉴定
• 2.2.3 pCVD442::△fimC 重组自杀质粒的构建
• 2.2.4 FimC 基因缺失突变菌株的构建
• 2.2.5 菌毛表达实验
• 2.2.6 与鸡气管粘膜的粘附实验
• 2.2.7 雏鸡的毒力检测
• 3 结果
• 3.1 E.COLI 02 FIMC 基因及其左右翼序列的鉴定
• 3.1.1 L-fimC-R 基因的PCR 扩增与纯化
• 3.1.2 pMD-L-fimC-R 的鉴定
• 3.1.3 02 菌株L-fimC-R 基因序列测定及同源性比较
• 3.2 PCVD442::△FIMC 自杀质粒的构建
• 3.2.1 FimC 基因左右臂片段的扩增
• 3.2.2 FimC 基因1716p 缺失片段的扩增
• 3.2.3 pMD-△fimC 克隆载体的鉴定
• 3.2.4 重组自杀质粒pCVD442::△fimC 的鉴定
• 3.3 FIMC 基因缺失突变菌株的构建
• 2（pCVD442::△fimC）的筛选'>3.3.1 菌株O₂（pCVD442::△fimC）的筛选
• 2（△fimC）（Nal^R）的筛选'>3.3.2 重组菌株O₂（△fimC）（Nal^R）的筛选
• 2（△fimC）菌株的鉴定'>3.3.3 O₂（△fimC）菌株的鉴定
• 3.4 菌毛表达实验
• 3.5 与鸡气管粘膜的粘附实验
• 3.6 雏鸡的毒力检测
• 2最小致死量的测定'>3.6.1 亲本菌O₂最小致死量的测定
• 3.6.2 雏鸡的致病性实验
• 4 讨论
• 4.1 pCVD442 自杀载体的生物学功能
• 4.2 缺失突变菌株的菌毛表达
• 4.3 缺失突变菌株对鸡气管上皮的粘附特性
• 4.4 FimC 基因的缺失对鸡大肠杆菌致病力的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文