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林麝Ⅱ类MHC基因分离与化脓性疾病的相关性研究

2020-12-29阅读(633)

林麝Ⅱ类MHC基因分离与化脓性疾病的相关性研究

论文摘要

林麝是我国兽类中具有极高经济价值和社会价值的一种资源动物。雄性林麝的麝香囊腺分泌的麝香在医药和香水行业具有非常重要的作用。近几十年来,随着国际市场对麝香的需求量不断增加以及人为的乱捕乱猎和栖息地破坏,林麝的数量不断下降,已到了邻近灭绝的边缘。人工养殖林麝已有50多年,但圈养林麝的种群因疾病等多种限制因素的困扰而发展缓慢。因此,非常有必要对这一物种展开科学研究,进一步加大保护力度。主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）是脊椎动物中多态性最高的一个超基因家族,其编码的细胞膜表面蛋白在识别、呈递外来抗原并引发下游免疫应答反应的过程中发挥着非常重要的作用,是脊椎动物适应性免疫系统的重要组成部分。一个有功能的MHCⅡ类分子是由一个α链和一个β链非共价结合形成的二聚体,其分别由MHCⅡ的A基因和B基因编码。MHCⅡ类A基因和B基因exon2编码的抗原结合区具有非常高的多态性,与物种抵抗病原体的能力及适应复杂的环境直接相关。本研究以四川养麝研究所的115只林麝个体为对象,通过对MHCⅡ类经典的DR和DQ座位的分离、遗传变异分析和化脓性疾病相关性的分析,揭示了林麝MHCⅡ基因多态性的维持机制及其与化脓性疾病的密切关系。主要的研究结果如下:1.利用通用引物获得Mobe-DR基因部分exon2序列的基础上,通过基因组步移法结合长程PCR法?成功地获取了DR基因exon2序列两侧的内含子序列,继而成功地设计了座位特异性引物,并通过群体调查结果证实了其有效性,最终获得一个DRA座位,一个DRB座位（DRB3）。2.利用通用引物获得Mobe-DQ基因部分exon2序列的基础上,通过长程PCR法,成功地获取了DQ基因完整的intron2序列。通过对长片段序列的比对分析,依据同源序列设计引物,成功地获取到部分intron1序列。所设DQ座位的特异性引物通过群体调查结果证实了其有效性。最终获得了两个DQA座位（DQA1&DQA2）和两个DQB座位（DQB1&DQB2）,3.本研究一共获得6个MHCⅡ经典座位,利用座位特异性的PCR-SSCP基因分型和测序方法,最终分离到34条等位基因（DRA,4条；DRB3,10条；DQAl,4条；DQA2,7条；DQB1,4条；DQB2,5条）。林麝的6个MHCII经典座位均为多态,与其他濒危的哺乳动物相比较,林麝的适应性免疫系统（MHCⅡ类）保留了较丰富的基因多样性。4.林麝MHCⅡA基因经研究表明均经历了净化选择,B基因则均经历了正选择,尤其是在B基因的抗原结合位点经历了显著的正选择作用,表明不同的座位经历了不同的选择压力。此外,系统发育分析表明跨物种进化是维持林麝各个座位基因多态性的主要机制之一。5.通过对化脓性疾病易感个体和抗病个体MHCⅡ各个座位上基因型和等位基因数据的统计学分析,与林麝化脓性疾病相关的等位基因一共有9条,其中4条等位基因（Mobe-DQA1*01, Mobe-DQA1*02, Mobe-DQA2*03和Mobe-DQB2*04）与化脓性疾病的抗性显著相关,有5条等位基因(Mobe-DRB3*07, Mobe-DQA1*03（or Mobe-DQAl*04）和Mobe-DQA2*05（or Mobe-DQA2*06）与化脓性疾病的易感性显著相关。与化脓疾病相关的基因型一共有13个,其中与抗性相关的基因型有6个（DRB3*01/03, DQA1*01/01, DQA1*01/02, DQA2*01/03, DQA2*02/04与DQB2*03/04（P<0.05））;与易感相关的基因型有7个（DRB3*07/07, DQA1*03/03, DQA2*01/01, DQA2*05/05, DQA2*05/06, DQB1*01/03与DQB2*01/02（P<0.05））.此外,利用各个座位上等位基因的抗原结合区形成的不同单倍型及其基因型数据,通过分析获得与化脓性疾病相关的超级单倍型一共有6条,单倍型H1（DRA*h1/DRB3*h1/DQA1*h1/DQA2*h2/DQB1*h1/DQB2*h2）与H2（DRA*h1/DRB3*h4/DQA1*h1/DQA2*h2/DQB1*h1/DQB2*h1）与化脓性疾病的抗性相关,单倍型H3（DRA*h1/DRB3*h1/DQA1*h3/DQA2*h3/DQB1*h3/DQB2*h2）, H4（DRA*h1/DRB3*h5/DQA1*h3/DQA2*h3/DQB1*h1/DQB2*h1）, H5（DRA*h1/DRB3*h7/DQA1*h3/DQA2*M/DQB1*h3/DQB2*h2）与H6（DRA*hl/DRB3*h7/DQA1*h3/DQA2*h3/DQB1*hl/DQB2*hl）则与化脓性疾病的易感性相关。推断Mobe-DRA*02及与其相关的基因型在抗病组具有极高的频率,因Mobe-DRA*02与大部分的超级单倍型连锁,尤其是抗病的超级单倍型连锁所致；同时,Mobe-DRA*03釉Mobe-DRA*04的抗原结合区虽然与Mobe-DRA*02完全一致,二者因与易感的超级单倍型连锁,致使其本身和与之相关的基因型在易感组的频率较高。Mobe-DQB2*02和Mobe-DQB2*03的抗原结合区完全一致,二者亦因分别与易感的和抗病的超级单倍型连锁而在易感组和抗病组中的等位基因频率较高。易感等位基因、基因型与超级单倍型数目均多于抗病的等位基因和基因型数目,暗示圈养林麝易患化脓性疾病确与群体中这些易感等位基因、基因型与超级单倍型有着密切的关系。建议适时地引入新的种源,防止近交引起的易感等位基因的纯合子和杂合子在群体中的数目继续增多,使种源衰退进一步恶化。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • Abstract
  • 目次
  • 第一部分 文献综述
  • 第1章 主要组织相容性复合体（MHC）及其应用
  • 1.1 MHC的分类、组织分布、结构与功能
  • 1.1.1 MHC的分类与组织分布
  • 1.1.2 MHCⅠ类的结构与功能
  • 1.1.3 MHCⅡ类的结构与功能
  • 1.1.4 MHC基因多态性的维持机制
  • 1.2 MHC在保护遗传学中的应用
  • 第2章 林麝研究综述
  • 2.1 林麝的生物学特征
  • 2.1.1 基本形态特征
  • 2.1.2 分类与分布
  • 2.1.3 食性与繁殖
  • 2.2 林麝的行为、生态及相关研究
  • 2.3 林麝的分子生物学相关研究
  • 2.4 致危根源与养殖现状
  • 2.4.1 麝香及致危根源
  • 2.4.2 人工养殖现状
  • 2.5 林麝化脓性疾病
  • 2.5.1 林麝化脓疾病的症状
  • 2.5.2 化脓疾病的病因及防治
  • 第3章 本研究的理论依据、研究内容及研究目的
  • 第二部分 实验材料与方法
  • 第4章 林麝MHC Ⅱ DR位点的分离
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 样品来源
  • 4.1.2 主要实验试剂
  • 4.1.3 主要实验仪器
  • 4.2 实验方法及步骤
  • 4.2.1 基因组DNA的提取
  • 4.2.2 林麝DRA位点的分离和等位基因的获取
  • 4.2.3 林麝DRB位点的分离和等位基因的获取
  • 4.3 实验结果及讨论
  • 4.3.1 林麝基因组DNA的提取结果
  • 4.3.2 林麝DRA基因exon 2通用引物调查结果
  • 4.3.3 林麝DRA基因exon 2侧翼序列的扩增结果
  • 4.3.4 林麝DRA座位特异性引物群体调查结果
  • 4.3.5 林麝DRB基因exon 2通用引物调查结果
  • 4.3.6 林麝DRB基因exon 2侧翼序列的扩增结果
  • 4.3.7 林麝DRB座位特异性引物群体调查结果
  • 4.4 实验小结
  • 第5章 林麝MHC Ⅱ DQ位点的分离
  • 5.1 实验材料
  • 5.1.1 样品来源
  • 5.1.2 主要的实验试剂
  • 5.1.3 主要的实验仪器
  • 5.2 实验方法和步骤
  • 5.2.1 林麝DQA位点的分离和等位基因的获取
  • 5.2.2 林麝DQB位点的分离和等位基因的获取
  • 5.3 实验结果和讨论
  • 5.3.1 林麝DQA基因exon 2-intron 2-exon 3序列的扩增结果
  • 5.3.2 林麝DQA基因exon 2侧翼intron 1序列的扩增结果
  • 5.3.3 林麝DQA1座位特异性引物群体调查结果
  • 5.3.4 林麝DQA2座位特异性引物群体调查结果
  • 5.3.5 林麝DQB基因exon 2通用引物调查结果
  • 5.3.6 林麝DQB基因exon 2侧翼序列扩增结果
  • 5.3.7 林麝DQB1座位特异性引物群体调查结果
  • 5.3.8 林麝DQB2座位特异性引物群体调查结果
  • 5.4 实验小结
  • 第6章 林麝MHC Ⅱ类基因多态性及维持机制
  • 6.1 数据处理
  • 6.1.1 序列的处理和分析
  • 6.1.2 系统发育分析
  • 6.2 基因多态性及维持机制
  • 6.2.1 林麝DR基因的遗传多样性及维持机制
  • 6.2.2 林麝DQA基因的遗传多样性及维持机制
  • 6.2.3 林麝DQB基因的遗传多样性及维持机制
  • 6.3 实验小结
  • 第7章 林麝化脓性疾病与MHC Ⅱ基因多态性的相关分析
  • 7.1 实验材料
  • 7.1.1 样品来源
  • 7.1.2 主要的实验试剂
  • 7.1.3 主要的实验仪器
  • 7.2 实验方法和步骤
  • 7.2.1 林麝粪便gDNA的提取
  • 7.2.2 林麝粪便基因组DNA的纯化
  • 7.2.3 林麝MHC DR & DQ基因的座位特异性PCR
  • 7.2.4 林麝MHC DR & DQ基因exon 2种群变异的SSCP分析
  • 7.3 数据处理
  • 7.4 实验结果和讨论
  • 7.4.1 林麝粪样基因组的提取结果
  • 7.4.2 林麝各个位点的粪样扩增及分型结果
  • 7.4.3 林麝MHCⅡ基因的基因型、等位基因频率统计
  • 7.4.4 林麝MHCⅡ基因易感组和抗病组的X
  • 2适合性检验
  • 7.4.5 林麝MHCⅡ基因多态性与脓肿病的关联分析
  • 7.5 实验小结
  • 第三部分 结论
  • 第8章 主要结论、创新内容及展望
  • 8.1 本研究的主要结论
  • 8.2 本研究的创新点
  • 8.3 展望
  • 参考文献
  • 博士期间科研经历

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