胆管癌药物的筛选及作用机理的研究

论文摘要

胆管癌是一种难以治愈的恶性肿瘤。对于胆管癌的治疗，根治性手术是目前唯一有效的办法。但是，胆管癌的早期症状不明显、发现困难，一旦发现多数已进入晚期，很难通过手术方法切除，因此，寻找其他非手术方法治疗胆管癌就变得十分必要。目前临床应用的药物对胆管癌敏感性欠佳，而且存在明显毒副作用。因此，探索更敏感、有效的药物，提高胆管癌药物治疗的疗效就变得十分必要。本论文以体外培养的人胆管癌QBC939细胞为药物筛选模型，选用叶下珠、珠子草、冬青、白英、长春花、三尖杉六种药用植物提取物、淡水贝类河蚬提取物、天然产物化合物、缩氨基硫脲类化合物及常见化疗药物，应用MTT测定法，从天然和化学合成物质中筛选具有抗胆管癌效应的药物。结果表明：珠子草和叶下珠的乙酸乙酯和正丁醇提取物、白英的水提物、长春花总碱、河蚬乙酸乙酯提取物、槲皮素、鞣酸、2-氯苯甲醛缩氨基硫脲和2，4-二氯苯甲醛缩氨基硫脲、三苯氧胺等具有体外抗胆管癌细胞增殖的活性。与胆管癌临床中常用的化疗药物5-氟尿嘧啶和顺铂相比，三苯氧胺表现出了更强的抑制胆管癌细胞的作用。因此，本研究选择三苯氧胺（TAM）进行下一步的深入研究，探讨三苯氧胺体外抗胆管癌作用的机理。通过MTT法、细胞形态观察法、流式细胞术、DNA ladder等方法研究表明：TAM呈时间和剂量依赖性抑制胆管癌QBC939细胞的增殖、使细胞形态发生明显变化、使细胞周期阻滞于G0／G1期、且显著诱导细胞凋亡；通过Western blot等方法研究表明：TAM对Cyclin D1、ERα、C-Myc蛋白表达的抑制、Caspase-3／Caspase-9信号通路的激活、Bax和p53蛋白表达的上调，是TAM发挥抗胆管癌作用的部分机制。为了进一步的探讨TAM抗胆管癌作用的分子机制和药物作用靶点，我们首次应用蛋白质组学技术研究了三苯氧胺对人胆管癌QBC939细胞全蛋白表达谱的影响。最终成功鉴定出热休克蛋白、细胞骨架蛋白、膜联蛋白和代谢相关酶等差异表达的蛋白点。结合这些蛋白的功能，全面系统地分析了三苯氧胺抗胆管癌作用的可能的分子机制。为胆管癌的药物治疗提供了新的线索，为三苯氧胺在临床上应用于胆管癌的治疗提供了基础理论支持，也为三苯氧胺抗胆管癌作用新靶点的阐明提供了新的思路和线索。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 胆管癌基础研究概况
• 1.1.1 胆管癌的分类
• 1.1.2 胆管癌的流行病学概况
• 1.1.3 胆管癌发生的高危因素
• 1.1.4 胆管癌发生的过程及分子生物学机制
• 1.1.5 胆管癌的临床症状及诊断
• 1.1.6 胆管癌的治疗
• 1.2 抗癌药物的筛选
• 1.2.1 药物筛选模型
• 1.2.2 抗癌药物的种类
• 1.2.3 抗癌药物作用的靶点
• 1.2.4 抗胆管癌药物研究现状
• 1.3 三苯氧胺在临床中的作用及作用机制
• 1.3.1 三苯氧胺在临床中的作用
• 1.3.2 三苯氧胺的作用机制
• 1.3.3 雌激素及其受体与胆管癌
• 1.4 蛋白质组学技术在胆管癌研究中的应用
• 1.5 本论文研究的内容和意义
• 2 实验试剂与仪器
• 2.1 主要材料和试剂
• 2.2 主要实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 药用植物的提取
• 3.2 河蚬的提取
• 3.3 肿瘤细胞的培养
• 3.4 MTT法测定细胞增殖率
• 3.5 细胞形态的观察
• 3.5.1 普通光学显微镜下细胞形态的观察
• 3.5.2 荧光显微镜下细胞形态的观察
• 3.5.3 透射电镜下细胞超微结构的观察
• 3.6 PI单染流式细胞术检测细胞周期变化
• 3.7 DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳
• 3.8 FITC-Annexin V/PI双染流式细胞术
• 3.9 Caspase-3活性的测定
• 3.10 细胞内活性氧ROS的测定
• 3.11 Western blot
• 3.11.1 细胞的裂解
• 3.11.2 免疫印迹
• 3.12 蛋白质组学技术方法
• 3.12.1 QBC939细胞全蛋白样品制备
• 3.12.2 等点聚焦电泳
• 3.12.3 SDS-PAGE电泳
• 3.12.4 考马斯亮蓝G-250染色
• 3.12.5 硝酸银染色
• 3.12.6 凝胶扫描和图像处理
• 3.12.7 差异蛋白点的胶内酶切与质谱分析
• 4 结果
• 4.1 抗胆管癌药物的筛选
• 4.1.1 药用植物提取物对体外培养的胆管癌QBC939细胞的作用
• 4.1.2 淡水贝类河蚬提取物对QBC939细胞增殖及细胞周期的影响
• 4.1.3 天然产物化合物对QBC939细胞增殖的影响
• 4.1.4 缩氨基硫脲类化合物对QBC939细胞增殖的影响
• 4.1.5 化疗药物对QBC939细胞增殖及细胞周期的影响
• 4.2 TAM抗胆管癌作用机制的研究
• 4.2.1 TAM对胆管癌细胞抑制作用的时间和剂量效应
• 4.2.2 TAM对不同肿瘤细胞敏感性的比较
• 4.2.3 TAM对胆管癌QBC939细胞形态学的影响
• 4.2.4 TAM对胆管癌细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin D1的影响
• 4.2.5 TAM诱导胆管癌细胞凋亡
• 4.2.6 TAM激活Caspase-9和Caspase-3
• 4.2.7 凋亡相关蛋白对TAM诱导的胆管癌细胞凋亡作用的调控作用
• 4.2.8 胆管癌细胞中ERα的表达及TAM作用后ERα表达的变化
• 4.2.9 TAM作用后QBC939细胞内活性氧的变化情况
• 4.2.10 TAM对QBC939细胞内PKCα蛋白表达的影响
• 4.2.11 TAM对QBC939细胞内C-Myc蛋白表达的影响
• 4.3 TAM作用后人胆管癌QBC939细胞全蛋白谱的差异表达变化
• 5 讨论
• 5.1 体外抗胆管癌药物的筛选
• 5.1.1 药用植物提取物对胆管癌细胞的影响
• 5.1.2 淡水贝类河蚬提取物对胆管癌细胞的影响
• 5.1.3 天然产物化合物对胆管癌细胞增殖的影响
• 5.1.4 缩氨基硫脲类化合物对胆管癌细胞增殖的影响
• 5.1.5 化疗药物对胆管癌细胞的影响
• 5.2 TAM体外抗胆管癌机制的研究
• 5.2.1 TAM对呈时间和剂量依赖性抑制QBC939细胞的增殖
• 5.2.2 胆管癌细胞较其他肿瘤细胞对TAM的作用更为敏感
• 5.2.3 TAM阻滞胆管癌细胞周期并诱导细胞凋亡
• 5.2.4 TAM下调胆管癌细胞中Cyclin D1蛋白的表达
• 5.2.5 TAM通过激活Caspase-9/Caspase-3诱导细胞凋亡
• 5.2.6 凋亡相关蛋白对TAM诱导的胆管癌细胞凋亡的调控
• 5.2.7 TAM能够抑制胆管癌QBC939细胞中ERα的表达
• 5.2.8 TAM诱导胆管癌细胞凋亡的其他非ER途径
• 5.3 利用蛋白质组学技术研究TAM抗胆管癌作用的可能分子机制
• 5.3.1 热休克蛋白
• 5.3.2 细胞骨架蛋白
• 5.3.3 代谢相关酶和蛋白
• 5.3.4 膜联蛋白
• 6 结论
• 7 参考文献
• 在学期间发表论文
• 致谢