siRNA对宫颈癌SiHa细胞中VEGF-165表达及细胞增殖影响的研究

论文摘要

目的:探讨小分子干扰RNA（siRNA）对宫颈癌细胞系SiHa细胞中VEGF-165的表达及细胞增殖的影响,对RNA干扰技术在肿瘤治疗领域中应用的可能性进行初步探讨,为下一步利用RNA干扰技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础。方法:体外化学合成针对VEGF-165的siRNA,用无静默效应荧光标记siRNA在转染试剂的介导下转染siHa细胞,荧光显微镜下监测其转染效率,筛选出siRNA和转染试剂的最适宜转染用量。实验分为3组,设未转染细胞为空白对照组,VEGF-165特异性siRNA转染的实验组及无关序列siRNA转染的阴性对照组。利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,荧光实时定量RT-PCR法分别检测转染12、24、48和72h后SiHa细胞中VEGF-165mRNA的表达情况,ELISA法检测细胞培养液中VEGF-165蛋白分泌量的变化。结果:VEGFsiRNA和HiPerFect Transfection Reagent的最佳质量体积比为75ng、4.5μl。VEGF-165siRNA转染SiHa细胞后,各时间点与对照组相比VEGFmRNA表达水平明显下降（F值分别为99.94、169.27、460.90、115.86,P＜0.05）;VEGF蛋白分泌量明显减少,差异有统计学意义（F值分别为107.06、136.46、147.10、54.25,P＜0.05）;细胞生长较对照组明显受到抑制（F值分别为70.58、61.17、113.39、100.94,P＜0.05）。而阴性对照组与空白对照组比较,上述指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论:VEGFsiRNA可以有效抑制宫颈癌SiHa细胞VEGFmRNA及其蛋白的表达水平,抑制细胞增殖。实验结果表明特异性siRNA能有效介导宫颈癌细胞出现RNAi,以VEGF作为靶点的肿瘤基因治疗及RNA干扰技术在肿瘤治疗领域中应用提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 实验仪器、试剂与耗材
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂与耗材
• 1.2.1 RNAi Human/Mouse Starter Kit
• 1.2.2 荧光定量RT-PCR试剂
• 1.2.3 血管内皮细胞生长因子ELISA试剂盒
• 1.2.4 RNA提取试剂
• 1.3 主要液体的配制
• 1.4 siRNA及引物的合成
• 第二章 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 siRNA干扰条件的优化及siRNA干扰
• 2.3 MTT法对转染后细胞生长增殖影响的测定
• 2.4 荧光定量RT-PCR检测VEGFmRNA的表达水平
• 2.5 ELISA法检测siRNA转染后各组VEGF蛋白分泌量的变化
• 2.6 统计学处理
• 第三章 实验结果及讨论
• 3.1 实验结果
• 3.2 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果
• 附录
• 致谢