乳酸菌NADH氧化酶的筛选与基因克隆研究

论文摘要

NADH氧化酶（NADH Oxidase，EC1.6.99.3，简写为NOX）是一种氧化还原酶类，直接将NADH氧化为NAD+。国外研究发现，很多微生物细胞中存在NADH氧化酶，它在辅酶再生和调控微生物代谢方面有重要作用。随着氧化还原酶的工业化应用日益发展，相应的辅酶再生问题成为研究热点。NOX由于反应物氧不需要另行加入，并且产物结构简单，对主要产物分离纯化无影响的优点，在氧化型辅酶NAD＋再生中表现出了巨大的应用潜力。本课题从泡菜中分离的乳酸菌中筛选出一株产NADH氧化酶酶活较高的乳杆菌（Lactobacillus sp. LP-01），并从中调出编码NADH氧化酶的目的基因nox（Genbank：HQ441199），对其进行了TA克隆和初步的生物信息学分析，同时对该段目的基因的克隆表达做了初步研究。首先，实验从泡菜中分离筛选了9株乳酸菌，并通过测NADH氧化酶酶活，得到一株酶活相对较高的乳酸菌株。16S rDNA测序鉴定结果表明其为乳杆菌，命名为Lactobacillus sp. LP-01。其次，对该菌NADH氧化酶基因进行了克隆。提出菌的基因组DNA后，应用通过基因比对所设计的简并引物，PCR扩增出目的片段。扩增出的nox基因（Genbank：HQ441199）TA克隆于pMD18-T载体并转入大肠杆菌E. coli DH5α中。测序表明目的基因nox，全长为1353bp，有完整的启动子和终止子，共编码450个氨基酸，产物分子量为486,000。氨基酸序列分析发现：基因编码产物含4个半胱氨酸，推测其参与了酶分子中二硫键的形成和肽链的折叠。肽链的N端为FAD-binding1（GCTHAGT），并有FAD-binding2结合区（TSDPDIYGAGDS），显示此酶与报道相符，催化中需要辅基FAD的参与。序列中还有一个NAD结合区（VIVIGGGYIGTELV），用以结合底物NADH。最后，对目的基因nox的表达进行了初步研究，实验以带有SalI和XhoI酶切位点的引物将基因克隆于表达载体pET-32a（+），并转化进入宿主菌BL21（DE3）pLysS中。随后进行了重组菌的发酵与酶蛋白的诱导，发酵产物以SDS-PAGE电泳验证，发现nox基因产物以胞内可溶蛋白和包涵体两种形态存在，进一步，对胞内可溶蛋白的初步酶活测定表明，这部分产物的NOX酶活为6.57U/g菌体。

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Abstract

第一章前言

1.1 NADH 氧化酶来源、结构及底物偏好

1.1.1 NADH 氧化酶的菌种来源与结构

1.1.2 NADH 氧化酶的底物偏好

1.2 NADH 氧化酶的生理作用和反应机理研究

1.2.1 NOX 在胞内的生理作用研究

1.2.2 反应机理研究

1.3 NADH 氧化酶分离纯化研究

1.4 NADH 氧化酶分子克隆研究

1.5 NADH 氧化酶应用进展

1.5.1 辅酶再生

1.5.2 人工调节 NOX 酶活，调控胞内代谢通路

1.6 NADH 氧化酶的应用前景

1.7 本课题研究的目的和意义

1.8 本课题研究的主要内容

第二章产 NADH 氧化酶乳酸菌的筛选、分离和鉴定

2.1 材料和方法

2.1.1 培养基和溶液

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 乳酸菌的筛选与分离

2.1.5 菌种培养与活化

2.1.6 NADH 氧化酶的粗提取

2.1.7 NADH 紫外吸收标准曲线的测定

2.1.8 NADH 氧化酶酶活的测定

2.1.9 NADH 氧化酶高酶活菌株的筛选

2.1.10 乳酸菌 16S rDNA 鉴定

2.1.10.1 乳酸菌核基因组的提取

2.1.10.2 通用引物

2.1.10.3 PCR 扩增

2.1.10.4 纯化扩增 PCR 产物

2.1.10.5 16s rDNA 序列测定与分析

2.2 结果与讨论

2.2.1 NADH 紫外吸收标准曲线

2.2.2 NADH 氧化酶高酶活菌株的筛选

2.2.3 乳酸菌核基因组和 16S rDNA PCR 结果

2.2.3.1 乳酸菌基因组的提取结果

2.2.3.2 乳酸菌 16S rDNA PCR 结果

2.3 本章小结

第三章 NADH 氧化酶基因的克隆

3.1 材料和方法

3.1.1 主要仪器和设备

3.1.2 材料和试剂

3.1.2.1 pMD 18-T 载体

3.1.2.2 主要试剂

3.1.3 培养基

3.1.4 nox 基因目的片段的获得

3.1.4.1 PCR 引物的设计和合成

3.1.4.2 PCR 扩增

3.1.4.3 目的片段的切胶纯化

3.1.4.4 目的片段的 T 连接

3.1.4.5 连接产物的转化

3.1.4.6 重组质粒的筛选及提取

3.2 实验结果与讨论

3.2.1 nox 基因的获得

3.2.2 pMD18-T-nox 载体克隆质粒和 PCR 检测

3.2.2.1 pMD18-T-nox 质粒载体的提取

3.2.2.2 重组 T 载体 PCR 检测

3.2.3 nox 基因的编码蛋白

3.2.4 稀有密码子分析

3.2.5 密码子偏好性分析

3.3 本章小结

第四章 nox 基因在大肠杆菌中的表达

4.1 实验材料

4.1.1 主要仪器和设备

4.1.2 表达载体 pET-32a（+）和分子常用试剂

4.1.3 常用溶液的配制

4.1.4 培养基

4.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂

4.2 实验方法

4.2.1 带酶切位点 nox 目的基因片段的获得

4.2.1.1 PCR 引物的设计和合成

4.2.1.2 PCR 扩增

4.2.2 重组表达载体 pET-32a（+）-nox 的构建

4.2.2.1 表达载体的制备

4.2.2.2 目的片段和载体的双酶切

4.2.2.3 载体与目的片段的体外连接

4.2.2.4 连接产物转化大肠杆菌 DH5a

4.2.2.5 重组子的筛选和质粒提取

4.2.2.6 宿主菌 BL21（DE3）pLysS 的转化

4.2.3 重组质粒 pET-32a（+）-nox 的鉴定

4.2.4 重组大肠杆菌的培养与诱导表达

4.3 实验结果与讨论

4.3.1 nox 目的基因片段的 PCR 结果

4.3.2 表达载体 pET-32a（+）和目的片段 nox 双酶切鉴定结果

4.3.3 双酶切片段的连接物检测

4.3.4 连接物转化 DH5a 提取质粒检测结果

4.3.5 重组子 pET-32a（+）-nox 双酶切鉴定

4.3.6 表达 NADH 氧化酶的 SDS-PAGE 及酶活测定

4.4 本章小结

第五章结论

5.1 基本结论

5.2 主要创新点

5.3 进一步研究的建议

参考文献

附录

致谢

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