胃泌素-shRNA表达载体的构建及其对胃癌细胞系BGC-823的效应

论文摘要

胃癌是世界上最常见致死性疾病之一。虽然在一些国家，其发病率与致死率有所下降，但从全球范围看其发病率依然居高不下。胃泌素是一种多肽激素，主要由胃肠道G细胞分泌，具有刺激胃酸分泌和对胃肠粘膜的营养作用。在胃癌细胞系BGC-823中，胃泌素被证明是胃癌细胞的生长因子。研究发现，胃泌素能增强BGC-823细胞系的运动，有促进肿瘤细胞转移的作用。此外，胃泌素通过其受体介导细胞内信号传导，使细胞山G0/G1期向S、G2/M期转化，促进细胞的增殖，抑制细胞凋亡。因此，胃泌素基因有可能作为胃癌基因治疗的一个有效的靶基因。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物体内的一种通过双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制。细胞内双链RNA在酶的作用下，形成20-25碱基大小的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNAs），siRNAs结合多组分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，抑制该基因在细胞内的翻译表达。RNAi已被成功用来抑制多种生物的基因表达，更为引人注目的是，其可以作为治疗肿瘤的新手段。RNAi技术已广泛被用于白血病、大肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌等多种人类肿瘤的研究，但应用其研究胃癌近年才有报道。由于人工合成siRNA的时效性限制，构建shRNA表达载体，建立相应基因抑制的细胞系成为目前该研究领域的趋势。在以往研究的基础上，本研究构建了胃泌素-shRNA表达载体。该载体带有neo抗性基因和绿色萤光蛋白基因。转染BGC-823细胞后，以绿色萤光蛋白的表达检测转染效率，以G418进行筛选，建立了胃泌素-shRNA表达载体稳定转染的胃癌细胞系。应用RT-PCR验证胃泌素在mRNA水平的抑制效应。通过流式细胞（Flow Cytometry，FCM）和MTT技术检测胃泌素-shRNA表达载体对BGC-823细胞的效应，为进一步深入研究胃泌素在胃癌发生作用的分子机制提供实验基础。材料与方法1．改建质粒pSUPER-EGFP-NRG由于质粒pSUPER-EGFP-NRG中BglⅡ酶切位点被破坏，无法插入外源DNA片段，因此首先对质粒pSUPER-EGFP-NRG进行改建。改建的载体含有BglⅡ酶切位点，不含有NRG编码序列。根据质粒pSUPER-EGFP-NRG的序列，设计一对引物（其中含有BglⅡ酶切位点），以质粒pSUPER-EGFP-NRG为模板，进行PCR。将回收的PCR产物克隆至pSUPER-EGFP-NRG中，构建重组体pSUPER-EGFP-I，酶切及测序鉴定。2．构建胃泌素-shRNA真核表达载体设计并合成一对编码胃泌素-shRNA的互补寡核苷酸片段，退火成双链，产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。将其克隆至pSUPER-EGFP-I中，构建胃泌素-shRNA真核表达载体pSUPER-EGFP-G，酶切及测序鉴定。3．细胞培养及转染胃癌BGC-823细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，加入浓度分别为100u/ml和100μg/ml的青霉素和链霉素。转染BGC-823细胞前，改用双无RPMI-1640培养基。用无内毒素质粒提取试剂盒抽提pSUPER-EGFP-G与pSUPER-EGFP-I。BGC-823细胞随机分为实验组、实验对照组和空白对照组，用LipofectamineTM2000转染试剂将pSUPER-EGFP-G转染入实验组，pSUPER-EGFP-I转染入实验对照组，空白对照组仅含脂质体LipofectamineTM 2000。4．筛选与扩增转染后的细胞铺满培养板后，按1：5的密度比传代至新的培养板。在含400μg/ml G418的RPMI-1640选择性培养基中筛选，每3d换一次培养基。约两周后，阳性细胞克隆形成，将单克隆细胞跳入24孔板，继续培养。细胞铺满培养板后，移入培养瓶继续培养。5．胃泌素-shRNA表达载体对胃癌细胞BGC-823的效应应用RT-PCR技术检测胃泌素mRNA的抑制水平；应用MTT法和流式细胞技术检测细胞增值和细胞周期的改变。6．统计学处理应用SPSS10.0统计软件对数据进行统计学处理，数值用（?）±s表示。应用单因素方差分析进行组间差异比较，以α=0.05为检验水准。结果1．胃泌素-shRNA真核表达载体的构建对pSUPER-EGFP-G进行酶切和序列分析，酶切图谱及插入序列与预期结果一致。2．RT-PCR结果胃泌素和β-actin扩增的片段分别为207bp和300bp，3组细胞扩增条带灰度比值（胃泌素/β-actin）的均值分别为：空白对照组，1.09±0.011；实验对照组，1.074±0.016；实验组，0.155±0.012。实验组比值较空白对照组有显著差别（P＜0.01）。实验对照组与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）。结果表明胃泌素-shRNA表达载体可有效抑制胃癌细胞系BGC-823中胃泌素基因的表达。3．MTT结果3组细胞存活率分别为空白对照组，0.988±0.042；实验对照组，0.958±0.033；实验组，0.734±0.026。实验组与空白对照组比较，其细胞增殖能力明显下降（q=15.426，P＜0.05）。结果表明胃泌素-shRNA表达载体可有效抑制胃癌细胞系BGC-823的增值。4．流式细胞实验结果实验组的BGC-823细胞，G0～G1期细胞由空白对照组的59.5％上升至62.7％，G1/M期细胞由空白对照组的10.1％上升为17.9％，而S期细胞由30.4％下降至19.4％。结论1成功构建了胃泌素-shRNA真核表达载体pSUPER-EGFP-G。2成功建立了胃泌素表达敲低（knock down）的胃癌细胞系。3通过沉默胃泌素基因，胃泌素-shRNA表达载体可有效抑制胃癌细胞系BGC-823的增值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 胃泌素-shRNA表达载体的构建及其对胃癌细胞系BGC-823的效应
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述部分
• RNA干扰应用新近展
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢