论文摘要
背景肺癌为当前世界大中城市发病率和死亡率占首位的恶性肿瘤。肿癌现有的治疗手段包括手术、放化疗和分子靶向治疗仍不尽人意,患者生存期无突破。我们前期的“十五”重点攻关计划和“十一五”科技支撑计划研究显示：中西医结合治疗Ⅲ、Ⅳ期非小细胞肺癌的中位生存期延长了3.57个月,尤以益气除痰方治疗脾虚痰湿型晚期NSCLC为优（中位生存期达401天）,而脾虚痰湿型肺癌占研究总例数的40.8%。益气除痰方经长期临床实践证明疗效确切,且无明显不良反应。然而中药复方对疾病的治疗是一个多组分、多靶点、多途径的整体调节过程,益气除痰方可能的作用靶点和效应是什么?本课题采用比较蛋白质组学的方法研究益气除痰方治疗肺癌的现代分子机制并探讨中药治疗肿瘤的科学依据。目的研究益气除痰方对小鼠LEWIS肺癌实体瘤生长的影响,用蛋白质组学的方法筛选治疗组与模型组的差异蛋白表达,寻找益气除痰方抗LEWIS肺癌的作用靶点,临床病理和进一步实验验证这些新筛选的特异性差异蛋白分子在肺癌发病及治疗中的作用机制及意义。方法1 C57BL小鼠80只,接种LEWIS肺癌细胞,造模第2天,随机分为模型组（生理盐水）和治疗组予益气除痰方3.0g/kg/d,每组40只,灌胃21d后,每组随机抽取20只,检测肿瘤体积、重量、肺转移灶。其余每组20只,观察其生存期。分别提取治疗组和模型组肿瘤组织的总蛋白,应用双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）系统获得蛋白点表达差异信息,运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）鉴定出差异蛋白质。并以Western blot和荧光定量PCR法对差异蛋白进行表达差异验证。2临床病理验证收集临床肺癌79例（鳞癌10例、腺癌69例）、癌旁组织6例、肿良性病变（炎症、增生）组织20例病理切片,采用免疫组化法检测各组Vimentin的表达。培养人肺腺癌A549细胞,分为对照组（20%无药血清）、20%益气除痰方含药血清组,划痕实验观察20%含药血清组细胞侵袭、转移能力的影响,RT-PCR检测细胞MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14 mRNA的表达。免疫组化法检测C57BL/6J小鼠LEWIS肺癌模型组、益气除痰方3.0g/kg/d组肿瘤组织中MMP-2、MMP-14的表达。3临床验证应用临床肺癌病理组织肺癌79例（鳞癌10例、腺癌69例）、癌旁组织6例、肺良性病变（炎症、增生）组织20例,组织芯片肺癌48例、癌旁组织48例及正常肺组织4例,免疫组化法检测prolyl 4-hydroxylase beta polypeptide（P4HB）在各组肺组织中的表达。培养人肺腺癌A549细胞,流式细胞术PI单染法检测DDP1.5μg/mL组、15%益气除痰方含药血清和两者联合用药组对A549细胞凋亡的影响,细胞免疫组化检测各组P4HB的表达,RT-PCR法检测联合用药组和DDP组P4HBmRNA的表达。结果1益气除痰方3.0 g/kg/d治疗组小鼠体重大于LEWIS模型组（P<0.01）,肿瘤体积、瘤重均明显小于LEWIS模型组（P<0.01）,肿瘤抑制率为57.21%。治疗组中位生存期为29.00±0.894d,平均生存时间29.60±0.530d，长于LEWIS模型组22.00±0.745d和22.90±0.497d（P<0.01）,生命延长率为42.85%。模型组肿瘤组织蛋白胶图编辑完共1139个点,治疗组肿瘤组织蛋白胶图编辑完共1186个点,匹配上921个点。治疗组与模型组差异蛋白点44个,治疗后上调6个,下降38个。质谱成功鉴定出37个蛋白,这些蛋白包括Vimentin, prolyl 4-hydroxylase beta polypeptide （P4HB）, protein disuLfide-isomerase A3 precursor （PDIA3）, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1 （HSP60）, EG433182 protein, mKIAA4049 protein, stress-induced phosphoprotein I （STIP1）, heat shock protein 5 precursor （HSP5P）, phosphoglucomutase 5, heat shock protein 9 （HSP9）, Hspdl protein等。Western blot法结果显示益气除痰治疗组Vimentin, HSP60, P4HB, PDIA3蛋白表达水平较模型组下降；Q-PCR结果显示益气除痰治疗组EG433182、HSP5P、HSP9、STIP1 mRNA表达水平较模型组下降,与蛋白质组学实验结论一致。2免疫组化检测临床肺癌、癌旁组织、肺良性病变（炎症、增生）组织Vimentin的表达结果显示,Vimentin强阳性表达率肺腺癌患者为34.78%,肺鳞癌为33.33%,癌旁组织为25%,肺良性组织病变为25%,多发转移的肺癌为62.5%,无转移的肺癌为21.74%,伴有感染的肺癌组织为58.33%,不伴感染的肺癌组织为41.86%。肺癌脾虚痰湿型为51.31%、肺郁痰瘀型为49.66%、阴虚痰热型为49.51%,气阴两虚型为50.22%。结果提示Vimentin在肺癌组织表达强,癌旁组织表达弱,正常肺泡上皮表达弱,炎症及转移明显的组织表达更强（P<0.05）；4种中医证型间差异无显著性（P>0.05）益气除痰方含药血清对A549细胞迁移实验结果表明,20%含药血清作用于A 549细胞12h后,迁移率分别为（18.6±2.8）%,对照组为（43.3±2.9）%；作用24 h后,细胞的迁移率分别为（43.1±3.3%）,对照组已经长满。两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR显示20%含药血清处理A549细胞24h,中药组可明显降低MMP-2、MMP-14 mRNA的表达,与空白对照组比较差异有显著性（P<0.01）,中药组和空白对照组MMP-1、MMP-9 mRNA的表达差异不显著（P<0.01）。免疫组化结果显示益气除痰方3.0 g/kg/d治疗组MMP-2、MMP-14表达降低,与模型组比较差异有显著性（P<0.01）,益气除痰方对C57BL/6J小鼠LEWIS肺癌细胞表达MMP-2、MMP-14有抑制作用。结果表明益气除痰方明显下调Vimentin表达,抑制A549细胞的运动能力,减少基质金属蛋白酶MMP2、MMP14的分泌,可能与益气除痰方逆转肺癌细胞上皮-间质转化有关。3免疫组化检测临床肺癌、癌旁组织、肺良性病变（炎症、增生）组织P4HB的表达结果显示,P4HB在腺癌、鳞癌的染色面积百分比分别为36.22±6.83%,35.01±7.25%,癌旁组织为21.93±7.69%,肺良性病变为27.87±5.73%,肿瘤组织表达明显强于癌旁组织及肺良性病变（P<0.01）；腺癌与鳞癌比较差异无显著性（P>0.05）肺癌脾虚痰湿型为39.01±7.11%,肺郁痰瘀型为38.29±6.93%,阴虚痰热型为38.89±6.58%,气阴两虚型为38.91±5.87%,各证型间P4HB表达差异无显著性（P>0.05）。肺癌组织芯片结果显示,P4HB染色面积百分比肺腺癌组织为36.96±7.89%,与其相应癌旁组织为23.93±5.62%；P4HB在肿鳞癌组织染色面积百分比为34.23±6.81%,与其相应癌旁组织为21.75±7.02%,肺正常组织为12.82±5.60%；P4HB在肺癌组织高表达,与癌旁组织、肺正常组织比较差异有显著性（P<0.05）；腺癌表达略强于鳞癌,但差异无统计学意义（P>0.05）。流式细胞术检测显示,联合应用15%含药血清和1.5μg/mLDDP组A549的凋亡率为37.00±1.13%,含药血清组为9.90±1.86%,DDP组为15.80±2.75%,联合用药组与单用含药血清组、DDP组比较差异有统计学意义（p<0.05）。细胞免疫组化检测P4HB结果显示,P4HB在应激反应时在人A549细胞高表达,联合用药组P4HB阳性染色面积百分比为22.27±7.11%,含药血清组为21.87±7.34%,DDP组为26.93±5.67%,联合用药组与单用含药血清组、DDP组比较差异有统计学意义（p<0.05）。单用DDP组可升高A549细胞P4HB的表达,与空白血清组比较差异有显著性（P<0.01）。RT-PCR检测P4HB mRNA的表达结果显示,DDP刺激的A549细胞模型组与15%含药血清的表达分别为0.521±0.109,0.314±0.093,中药组较模型组明显降低（P<0.01）。结果提示,益气除痰方含药血清可下调DDP刺激诱导的P4HB的表达。结论益气除痰方具有抗肿瘤作用,蛋白质组学研究发现了两条新的中药抗肿瘤作用机制,P4HB, PDIA3, STIP1, HSP5P, HSP9等三分之一的差异蛋白均为分子伴侣或相关蛋白,提示抗癌中药可能具有调控内质网非折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）作用,并基于此机制抑制肺癌的发生和生长过程；Vimentin是差异表达最显著的蛋白,提示益气除痰方明显下调LEWIS肺癌小鼠Vimentin的表达,抗转移可能是益气除痰方治疗肺癌的作用机制之一,这可能与益气除痰方逆转肺癌细胞上皮-间质转化（EMT）有关,值得进一步研究。
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