小菜蛾颗粒体病毒瞬时表达实验系统的构建及其晚期表达因子在非受纳细胞系Sf-9中的功能分析

论文摘要

杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的病毒,因其病毒体的形态呈杆状而得名。杆状病毒基因的表达具有时序性,按照表达时相的不同可以分成早期表达和晚期表达。早期表达不依赖于病毒基因的编码产物,而晚期表达则依赖于病毒DNA的复制和病毒早期表达产物。杆状病毒代表种苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒iAutographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)中已经鉴定出19个晚期表达因子（late expression factor,lef）基因。小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulovirus,PlxyGV）属于杆状病毒科颗粒体病毒属,其宿主小菜蛾是一种主要的十字花科作物害虫。PlxyGV作为生物杀虫剂具有广阔的应用前景。受限于受纳细胞系的短缺,目前有关颗粒体病毒基因表达调控的研究工作报道不多。本文的研究工作致力于建立PlxyGV瞬时表达实验系统,在此基础上进行PlxyGV晚期表达因子基因的识别和功能分析,主要包括以下内容：（一）构建了PlxyGV瞬时表达实验系统,包括PlxyGV基因组cosmid文库、PlxyGV晚期表达因子瞬时表达质粒文库和PlxyGV晚期报告质粒。然后从文库中筛选出了覆盖PlxyGV基因组的五个重叠cosmids。根据已报道的PlxyGV基因组序列克隆了存在于PlxyGV基因组中的15个晚期表达因子基因同源基因,并构建了全部lef同源基因的瞬时表达质粒。用五种昆虫细胞系进行了PlxyGV晚期基因瞬时表达试验。（二）在瞬时表达实验中,用PlxyGV晚期表达因子基因分别逐一替换AcMNPV中相应的晚期表达因子基因。结果表明仅PlxyGV lef-2基因可以部分替代AcMNPV lef-2的功能。（三）借助计算机辅助软件,对目前基因组序列己知的51种杆状病毒晚期表达因子编码产物进行检索和比对,并按照lef基因编码产物的同源性对这些杆状病毒进行遗传分析,制作了分类关系的进化树,为研究杆状病毒晚期表达因子的功能与杆状病毒进化的关系提供了一定的参考。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 一. 前言
• 1.1 杆状病毒晚期表达因子
• 1.1.1 杆状病毒
• 1.1.2 杆状病毒基因表达调控
• 1.1.3 杆状病毒晚期表达因子
• 1.2 小菜蛾颗粒体病毒
• 1.3 研究目的和意义
• 二. 实验材料和工具
• 2.1 试剂与试剂盒
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 试剂盒
• 2.2 酶及分子量标准
• 2.3 菌株和细菌培养基
• 2.3.1 大肠杆菌菌株
• 2.3.2 细菌培养基
• 2.4 细胞系和细胞培养基
• 2.4.1 昆虫细胞系
• 2.4.2 细胞培养基
• 2.5 质粒和引物
• 2.5.1 克隆载体
• 2.5.2 AcMNPV瞬时表达实验系统
• 2.5.3 测序引物
• 2.6 病毒株
• 2.7 主要仪器设备
• 三. 实验方法和步骤
• 3.1 PlxyGV cosmid文库的构建
• 3.1.1 小菜蛾的饲养
• 3.1.2 病毒的扩增和纯化
• 3.1.3 病毒DNA的提取
• 3.1.4 文库的构建
• 3.1.5 文库的筛选
• 3.2 PlxyGV晚期表达因子瞬时表达质粒文库的构建
• 3.2.1 目的基因PCR引物设计
• 3.2.2 目的基因的扩增和载体的制备
• 3.2.3 目的基因和载体的体外双酶切
• 3.2.4 体外连接反应
• 3.2.5 连接产物转化大肠杆菌
• 3.2.6 重组质粒的筛选和鉴定
• 3.3 PlxyGV晚期表达报告质粒的构建
• 3.3.1 PlxyGV晚期报告质粒的构建
• 3.3.2 PlxyGV极晚期报告质粒的构建
• 3.4 瞬时表达实验
• 3.4.1 细胞培养
• 3.4.2 转染
• 3.4.3 荧光素酶（luciferase,LUC）活性检测
• 3.4.4 β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase,GUS）活性检测
• 3.5 计算机辅助分析
• 3.5.1 序列比对
• 3.5.2 比对数据浏览
• 3.5.3 构建进化树
• 3.5.4 进化树可信度评估
• 四. 实验结果
• 4.1 PlxyGV cosmid文库的构建
• 4.1.1 PlxyGV DNA的提取
• 4.1.2 文库构建与筛选
• 4.1.3 PlxyGV基因组DNA cosmid文库的鉴定分析
• 4.2 PlxyGV晚期表达因子瞬时表达质粒文库和报告质粒
• 4.3 PlxyGV晚期报告基因在不同细胞系中的瞬时表达实验结果
• 4.4 PlxyGV瞬时表达实验系统不支持AcMNPV晚期报告质粒表达
• 4.5 PlxyGV LEF-2能部分替代AcMNPV LEF-2的功能
• 4.6 PlxyGV部分晚期表达因子与其它杆状病毒同源蛋白的进化关系
• 五. 讨论
• 5.1 PlxyGV受纳细胞系的筛选
• 5.2 PlxyGV晚期表达因子在Sf-9中的功能分析
• 5.3 进化树构建方法的分析
• 5.4 PlxyGV晚期表达因子蛋白的进化特点
• 参考文献
• 文章中的缩略词
• 在校期间撰写的论文
• 致谢