检测A群猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备

论文摘要

猪轮状病毒感染在我国和世界各养猪国家普遍存在。快速准确地疾病监测是防治该病的前提条件,虽然轮状病毒检测有多种方法,但适用于现场对病原作出快速检测的方法还很有限,基于此本研究运用胶体金免疫层析技术,建立一种快速、简便、灵敏的检测A群猪轮状病毒的方法。将纯化的重组PRV VP6蛋白免疫兔子,制备得到抗VP6蛋白的多克隆抗血清;用抗PRV VP6蛋白杂交瘤细胞株C5D10注射BALB/C小鼠,制备得到抗PRV VP6蛋白腹水单抗。采取辛酸-硫酸铵盐析法和蛋白A（及G）亲和层析法对多克隆抗血清和腹水单抗进行两步纯化,纯化后的抗体用间接ELISA和SDS-PAGE检测其效价和提纯效果,SDS-PAGE结果显示提纯后的抗体没有杂带,主要为γ球蛋白,纯化后的单抗与多抗同VP6蛋白ELISA效价分别为10-5和1:1200;采用柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金颗粒,胶体金标记纯化后的单抗,最佳标记量和最适pH值的测定结果分别为60μg/ml和PH8.5,低温超速离心法纯化标记好的金标单抗;纯化后的胶体金标记抗体作1:2.5稀释,吸附于玻璃纤维。用纯化后的多抗在硝酸纤维素膜（HF135）上划线作为检测线,最适划线浓度为0.8mg/ ml;用羊抗鼠IgG在硝酸纤维素膜（HF135）上划线作为质控线,最适划线浓度为0.5 mg/ml。检测试纸条对PRV培养液和未接种病毒的细胞对照液作为已知阳性和阴性进行实验,检测时间约10min,病毒培养液在检测线和质控线出现两条明显的红色条带,检验结果为阳性,而细胞对照液只在质控线上出现红色条带,在检测线未出现,检验结果呈阴性,与预期设计的结果相一致。对试纸条进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示:试纸条检出病毒培养液（TCID50是0.1ml 10-6.25）最低限度为1:32稀释;不同批次试纸条重复检测,结果无明显差异;试纸条不与猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒相关腹泻病毒发生反应,表明所制备的试纸条具有一定的敏感性、重复性和特异性。本研究所建立的检测抗原的胶体金免疫层析试纸条,为猪轮状病毒病的快速诊断奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 轮状病毒的研究进展
• 1.1.1 轮状病毒粒子的形态结构
• 1.1.2 轮状病毒表面抗原与分型
• 1.1.3 轮状病毒的培养特性和理化特性
• 1.2 猪轮状病毒流行病学研究
• 1.3 轮状病毒诊断方法
• 1.3.1 RV 主要的诊断和检测方法
• 1.3.2 猪轮状病毒诊断方法
• 1.4 免疫胶体金概述
• 1.4.1 免疫胶体金技术的原理
• 1.4.2 免疫胶体金技术的特点
• 1.4.3 免疫胶体金技术的应用
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物与细胞
• 2.1.2 病毒
• 2.1.3 免疫原
• 2.1.4 主要试剂和溶液
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 PRV-VP6 单抗腹水的制备和纯化
• 2.2.2 兔抗VP6 多克隆抗体的制备与纯化
• 2.2.3 胶体金的制备和抗体的标记
• 2.2.4 试纸条的制作
• 2.2.5 制作试纸条最佳条件的确定
• 2.2.6 试纸条的性能测试
• 3 结果
• 3.1 抗猪轮状病毒VP6 蛋白多克隆抗血清的制备和纯化结果
• 3.1.1 重组抗原VP6 在大肠杆菌的表达及纯化结果
• 3.1.2 抗猪轮状病毒VP6 蛋白多克隆抗血清的纯化结果
• 3.2 抗猪轮状病毒VP6 蛋白单抗的纯化结果
• 3.3 金标抗体制备过程中条件的确定结果
• 3.3.1 胶体金制备过程中柠檬酸三钠加入量的确定结果
• 3.3.2 PRV-VP6 单抗与胶体金结合最佳pH 测定
• 3.3.3 胶体金标记抗体最适量的确定
• 3.4 胶体金与金标抗体的质量鉴定结果
• 3.4.1 胶体金颗粒的质量鉴定
• 3.4.2 金标抗体的鉴定
• 3.5 制作试纸条最佳条件的筛选结果
• 3.5.1 硝酸纤维素薄膜（NCM）的选择结果
• 3.5.2 硝酸纤维素膜（NCM）封闭剂浓度的选择结果
• 3.5.3 硝酸纤维素膜（NCM）抗体包被浓度的确定
• 3.5.4 金标抗体稀释倍数的选择结果
• 3.6 胶体金试纸条的测试结果
• 3.6.1 试纸条的检测结果
• 3.6.2 敏感性实验结果
• 3.6.3 特异性实验结果
• 3.6.4 重复性实验结果
• 4 讨论
• 4.1 胶体金免疫层析试纸条在检测猪轮状病毒的潜在应用价值
• 4.2 关于抗体的纯化
• 4.3 金颗粒的制备与标记
• 4.4 试纸条的制作
• 4.4.1 试纸条制作工艺
• 4.4.2 试纸条材料的选择问题
• 4.4.3 试纸条制作各种用量的确定
• 4.4.4 试纸条的组装和保存
• 4.4.5 假阳性的原因分析和解决方案
• 4.5 制作胶体金免疫层析试纸的原理
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文