豌豆镁离子螯合酶Ⅰ亚基与硫氧还蛋白f的功能研究

论文摘要

镁离子螯合酶是叶绿素生物合成途径(镁分支)中的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中形成镁原卟啉IX,对叶绿素的生物合成起到关键性的调控作用。镁离子螯合酶由三个亚基组成,分别为I亚基,D亚基和H亚基。这些亚基除了相互作用形成镁离子螯合酶复合物行使功能以外,还参与其他的代谢途径；同时也存在一些辅助蛋白与这些亚基相互作用,从而来影响镁离子螯合酶的活性,继而控制叶绿素的合成。镁离子螯合酶的一个重要的辅助蛋白是GUN4蛋白,它与H亚基相互作用,并且可以结合镁离子螯合酶的底物,从而促进镁离子螯合酶的活性。最近日本一个研究小组发现,在拟兰芥中,硫氧还蛋白可以调控镁离子螯合酶I亚基的氧化还原状态,从而影响其ATP酶活性。为了利用豌豆体系在叶绿体研究中的便利研究硫氧还蛋白对镁离子螯合酶I亚基的调控作用,首先,我们将NCBI数据库中I亚基已有序列进行氨基酸序列比对,选择完全同源的氨基酸序列设计兼并引物,用PCR得到豌豆中一段I亚基的cDNA序列,根据此cDNA设计基因特异性引物,用PCR的方法筛选豌豆叶片λgt11全长cDNA文库并通过5’RACE的方法,得到豌豆I亚基基因的全长cDNA,该cDNA长度为1452bp,具有一个1266bp的完整开放阅读框,可编码422个氨基酸,该蛋白理论分子质量约为45.98 KD,等电点约为5.43。然后,通过在大肠杆菌中表达外源重组的豌豆镁离子螯合酶I亚基和硫氧还蛋白f,经过镍离子亲和层析,我们获得了I亚基和硫氧还蛋白f外源重组蛋白。体外生化实验结果表明,豌豆硫氧还蛋白f能够还原镁离子螯合酶I亚基使其处于还原状态,从而激活I亚基的ATP酶活性和镁离子螯合酶活性。为进一步研究硫氧还蛋白f对镁离子螯合酶的调控机理,我们利用酵母点对点实验研究硫氧还蛋白f与镁离子螯合酶各个亚基以及GUN4蛋白的相互作用情况,结果表明在酵母中硫氧还蛋白f只与I亚基有相互作用,与其它亚基和GUN4蛋白没有相互作用。最后,我们利用病毒介导的基因沉默(virus induced gene silencing)技术,分别获得I亚基和硫氧还蛋白f基因沉默的豌豆植株。I亚基基因沉默植株中的叶片,茎,花萼和种皮都出现黄化的表型,叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量下降以及镁离子螯合酶活性几乎检测不到,硫氧还蛋白f基因RNA水平表达量下降。但是硫氧还蛋白f基因沉默植株没有明显表型,叶绿素和类胡萝卜素含量以及镁离子螯合酶活性都不变,而且I亚基基因RNA水平表达量不变。所有的这些实验结果,都将加深我们对硫氧还蛋白f和I亚基的了解。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 高等植物中叶绿素的研究
• 1.1.2 镁离子螯合酶的研究近况
• 1.1.3 植物体中对硫氧还蛋白的研究
• 1.2 问题的提出
• 1.3 课题研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 质粒和菌种
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 材料的培养
• 2.2.2 豌豆chlI基因的克隆
• 2.2.2.1 设计兼并引物克隆chlI基因的同源序列
• 2.2.2.2 PCR法从豌豆叶片cDNAλgt11噬菌体文库中筛选豌豆chlI基因
• 2.2.2.3 5'RACE实验得到完整的豌豆chlI基因
• 2.2.3 豌豆chlI基因和trx-f基因的体外表达纯化及活性影响
• 2.2.3.1 原核表达载体的构建
• 2.2.3.2 融合蛋白的诱导表达与纯化
• 2.2.3.3 Trx-f蛋白对CHLI的ATPase活性影响
• 2.2.3.4 Trx-f蛋白对镁离子螯合酶活性的影响
• 2.2.3.5 用纯化的蛋白免疫兔子制备兔抗
• 2.2.4 酵母双杂交研究Trx-f蛋白与镁离子螯合酶各亚基的相互作用
• 2.2.4.1 酵母双杂交系统中AD/BD载体的构建
• 2.2.4.2 酵母转化
• 2.2.5 利用VIGS技术分析chlI和trx-f基因的功能
• 2.2.5.1 VIGS载体的构建
• 2.2.5.2 农杆菌介导的转化
• 2.2.5.3 确定各抑制植株中沉默基因在转录水平上的变化
• 2.2.5.4 分析各基因抑制植株中镁离子螯合酶活性的变化
• 2.2.5.5 分析各基因抑制植株中几个关键色素含量的变化
• 2.2.5.6 分析各基因抑制植株中与抗逆有关的酶活性变化
• 3 结果分析
• 3.1 豌豆chlI基因的克隆
• 3.1.1 兼并引物扩增豌豆chlI基因的部分片段
• 3.1.2 PCR方法筛选豌豆cDNA λgt11噬菌体文库
• 3.1.3 5'RACE实验得到chlI基因的完整序列
• 3.2 蛋白的表达纯化及活性检测
• 3.2.1 CHLI和Trx-f蛋白的表达纯化
• 3.2.2 Trx-f蛋白对CHLI亚基蛋白的ATPase活性影响
• 3.2.3 Trx-f蛋白对Mg-chelatase活性的影响
• 3.3 Trx-f蛋白与镁离子螫合酶各亚基的相互作用
• 3.4 VIGS技术研究chlI基因和trx-f基因的功能
• 3.4.1 植株的表型变化
• 3.4.2 VIGS-chlI和VIGS-trx-f植株中镁离子螯合酶活性的变化
• 3.4.3 VIGS-chlI和VIGS-trx-f植株的光合色素合成能力
• 3.4.4 VIGS-trx-f植株的抗逆性酶合成能力
• 4 讨论
• 4.1 豌豆Trx-f蛋白对镁离子螯合酶Ⅰ亚基ATP酶活性的影响
• 4.2 豌豆Trx-f蛋白对豌豆镁离子螯合酶活性的影响
• 4.3 Trx-f蛋白与镁离子螯合酶各个亚基的相互作用
• 4.4 利用VIGS技术在豌豆植物体内研究Trx-f蛋白的功能
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 1 Reagents for screening λgt11 cDNA library
• 2 Reagents for plasmid DNA extraction
• 3 Reagents for protein purification
• 4 Reagents for yeast two-hybrid
• 5 Reagents for VIGS
• 致谢