NPM基因与辐射诱导的染色体不稳定性

论文摘要

辐射诱导的基因组不稳定性是多级致癌理论中一个关键的早期事件,在致癌过程中起着重要作用。染色体不稳定性是基因组不稳定性的表现形式之一,是多种恶性肿瘤的普遍特征。迄今为止,国内外对辐射诱导染色体不稳定性的调控因子及调节机制尚不清楚。因此探寻其调控的关键基因及其作用机制,对于阐明辐射致癌的可能机制具有重要的理论价值,同时可能为肿瘤早期诊断和治疗提供新的检测手段和治疗策略。核磷蛋白（Nucleophosmin,NPM或B23）是一种多功能的核仁磷酸化蛋白,参与核糖体的装配运输、DNA复制、中心体复制和有丝分裂等活动,其功能的发挥与p53状态密切相关。它在增殖活跃的细胞如肿瘤细胞和干细胞中呈过度表达,被认为是细胞增殖、DNA损伤后细胞存活不可缺少的关键基因,尤其在启动中心体复制、维持染色体稳定性方面起着重要的作用。目前关于NPM在辐射诱导染色体不稳定性中的作用尚不清楚,国内外均未见相关报道,NPM与p53的作用一直存在争议。本研究采用不同p53状态的人淋巴母细胞系TK6（wt p53）和WTK1（mt p53）细胞,观察NPM mRNA和蛋白的差异表达与细胞增殖的关系,检测NPM基因突变情况,以及在辐射诱导条件下NPM基因表达与细胞凋亡、染色体数目变化的关系,采用Olomoucine抑制NPM蛋白磷酸化,研究NPM基因与辐射诱导染色体不稳定性及p53的关系,对NPM的作用机制作初步的探讨。研究内容分为以下四个部分:第一部分:NPM基因在人淋巴细胞中的差异表达与细胞增殖目的研究不同p53状态的淋巴母细胞株和人正常淋巴细胞永生化细胞系的增殖能力、染色体数量与NPM表达的关系。方法在常规悬浮培养条件下,用软琼脂克隆形成法检测人淋巴母细胞株TK6（wt p53）、WTK1（mt p53）和人正常淋巴细胞永生化细胞系的增殖能力,常规染色体分析技术检测染色体数量的变化,同时采用RT-PCR、Westen Blot检测NPM mRNA、总蛋白及磷酸化蛋白表达。结果p53突变型WTK1细胞的克隆形成能力约为p53野生型TK6细胞的2.75倍,两者均显著高于人正常淋巴细胞永生化细胞系的克隆形成能力约41倍和15倍。TK6和WTK1细胞的非整倍体率均约为54%,但TK6细胞98%以上为整/近二倍体细胞,未发现有整/近四倍体及以上细胞,而WTK1细胞整/近二倍体细胞约占83%,整/近四倍体及以上细胞占11.4%。人正常淋巴细胞永生化细胞系（HNILL）、TK6和WTK1细胞的NPM mRNA表达量为HNILL＜TK6＜WTK1,但三者之间无显著性差异:WTK1细胞NPM蛋白和磷酸化蛋白表达显著高于TK6细胞,两者均显著高于人正常淋巴细胞永生化细胞。结论p53突变型WTK1细胞与p53野生型TK6细胞、人正常淋巴细胞永生化细胞相比具有较强的细胞增殖能力且多倍体细胞所占比例高,三种细胞的增殖能力、染色体不稳定性与NPM mRNA、蛋白和磷酸化蛋白表达呈正相关,而且与p53的状态密切相关。第二部分:NPM基因在人淋巴细胞中的突变分析目的观察TK6和WTK1细胞是否存在累及NPM基因的5号染色体易位或NPM第12外显子的突变情况,探讨细胞增殖能力变化是否与NPM基因突变有关。方法采用染色体G显带分析法检测TK6和WTK1细胞的染色体畸变,采用双脱氧末端终止法（Sanger法）检测NPM第12外显子的突变情况,与人正常淋巴细胞永生化细胞系和2名健康人外周血淋巴细胞相比较。结果TK6和WTK1细胞NPM第12外显子非编码区存在杂合T缺失,与1名健康青年人外周血淋巴细胞的测序结果完全相同;人正常淋巴细胞永生化细胞存在第12外显子非编码区纯合T缺失,但TK6、WTK1细胞、人正常淋巴细胞永生化细胞和1名健康青年人外周血淋巴细胞的NPM基因第12外显子的编码区均未发生突变。另1名健康青年人外周血淋巴细胞的测序结果与GenBank数据库序列完全一致。人正常淋巴细胞永生化细胞系、TK6、WTK1和1名健康青年人外周血淋巴细胞染色体G带分析均未发现有与5号染色体相关的易位。结论在TK6和WTK1细胞中与NPM相关的功能只与NPM基因的表达有关。第三部分:γ射线照射对TK6和WTK1细胞NPM表达及染色体不稳定性的影响目的探讨辐射诱导的凋亡、染色体不稳定性与NPM表达、p53之间的关系。方法用4Gy 137Csγ放射源（剂量率为0.89Gy/min）照射TK6和WTK1细胞,采用流式细胞术检测照射后24h的细胞凋亡率;常规染色体分析技术检测照射后0h、6h、12h、24h、48h染色体数目变化;采用RT-PCR方法检测0h、1h、3h、6h、12h、24h NPM mRNA表达的变化:采用Western Blot检测照射后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h的NPM总蛋白及磷酸化蛋白的变化。结果4Gyγ射线照射后24h,TK6和WTK1细胞的凋亡率均显著高于未照射对照组,且TK6细胞的凋亡率显著高于WTK1细胞。4Gy照射后从6h开始至48h,TK6与WTK1细胞非整倍体率均明显高于未照射对照组,从未照射时的54.3%增加至79～85%;照射后48h TK6与WTK1细胞的多倍体率明显增加,TK6细胞由未照射时的1.4%升高到13.5%,主要为整/近三倍体从1.4%增加至10.8%,整/近四倍体从0%增加至2.7%;而WTK1细胞的多倍体率则由未照射时的17.1%升高到67%,主要表现为整/近四倍体从11.4%增加至48%,整/近三倍体从4.3%增加至12%。TK6细胞在4Gy照射后0-24h NPM mRNA表达无明显变化,照射后0-48h NPM蛋白及磷酸化蛋白水平亦无明显变化,而WTK1细胞于照射后12-24h NPM mRNA表达较未照射时降低,NPM蛋白水平于照射后12-48h显著低于未照射对照组,但磷酸化NPM蛋白于照射后12h-24h呈现短暂的升高后降至未照射组的水平。结论辐射诱导p53突变型WTK1细胞的染色体不稳定性显著高于p53野生型的TK6细胞,而TK6细胞的凋亡率明显高于WTK1细胞,可能与γ射线诱导NPMmRNA、蛋白及磷酸化蛋白表达及p53状态有关。第四部分:Olomoucine对辐射诱导细胞凋亡与染色体不稳定性的影响目的:观察Olomoucine抑制CDK2/cyclin E激酶活性后,对辐射诱导细胞凋亡和染色体不稳定的影响。方法:TK6和WTK1细胞用10μmol/L的Olomoucine处理6h后接受4Gyγ射线照射,分别于照后24h与48h检测细胞凋亡和染色体数目的变化。结果:Olomoucine使4Gy照射诱导的TK6和WTK1细胞的凋亡率比单纯照射组显著增加,TK6细胞由33.5%上升到43.9%,而WTK1细胞由16.8%升高到25.1%,且TK6细胞的凋亡率明显高于WTK1细胞。照后48h Olomoucine使TK6细胞的多倍体率由单纯照射的13.5%降至为0,WTK1的多倍体细胞所占比例由单纯照射组的67%降至18%,恢复至未照射对照组水平,但Olomoucine对辐射诱导TK6和WTK1细胞非整倍体率的增加无抑制作用,而且Olomoucine使辐射诱导的细胞凋亡和多倍体降低在两种细胞之间无明显差别。结论:Olomoucine通过抑制NPM蛋白的磷酸化能够显著提高辐射诱导的细胞凋亡,维持染色体的稳定性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 NPM基因在人淋巴细胞中的差异表达与细胞增殖
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 NPM基因在人淋巴细胞中的突变分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 γ射线照射对TK6和WTK1细胞株NPM表达及染色体不稳定性影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 Olomoucine对辐射诱导细胞凋亡与染色体不稳定性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文小结
• 附录一
• 综述
• 发表论文及获奖
• 致谢