企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制

论文摘要

镉（Cd）为慢性蓄积性毒物,对肾脏、肺、肝、神经系统以及血液系统均可产生毒性,并且具有致癌、致畸和致突变的作用。由于人类的各种活动,特别是近代工业的发展,使生存环境受到了广泛的Cd污染,工业“三废”中排放的Cd对人和动物的危害也日益受到重视。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸（ Cys）、并能被金属诱导合成的金属结合蛋白。MT的一个显著的特点就是能在转录水平上被环境中的金属所诱导,其表达水平的高低与环境中的金属浓度有直接的关系。因此,20世纪70年代就有人提出将水生生物体内的MT含量作为水环境污染的生物标志物。双壳贝类作为底栖生物,它生活在沉积物与水体的界面,通常认为其生物体内的重金属含量与周围水生环境污染的程度密切相关,能够真实反映环境的污染状况,因此其体内的MT可作为水生环境重金属污染的指示物。本研究用CdCl2诱导企鹅珍珠贝合成Cd-MT,并对Cd-MT进行分离纯化,制备了兔抗企鹅珍珠贝Cd-MT多克隆抗体,建立Cd-MT的ELISA检测方法,初步研制了相应的试剂盒,为贝类Cd-MT的检测提供一种快速、灵敏、简便的检测方法。主要内容如下:1.企鹅珍珠贝Cd-MT的诱导、提纯及鉴定:用不同浓度的CdCl2诱导企鹅珍珠贝合成Cd-MT,结果表明,企鹅珍珠贝体内的Cd-MT含量随着CdCl2胁迫浓度的增大而增加;采用Sephadex G-50凝胶过滤层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析对Cd-MT进行分离纯化,SDS-PAGE显示,纯化后的Cd-MT及其二聚体分子量分别为9kDa和18kDa;每个Cd-MT分子含有约19.2个巯基;脱金属后Cd-MT在254nm处的特征峰吸收消失,且吸光度值降低。2.兔抗企鹅珍珠贝Cd-MT多克隆抗体的制备、提纯与鉴定:将Cd-MT与BSA偶联,SDS-PAGE显示偶联物的分子量大于70kD;用此偶联物对家兔进行免疫,获得效价达1:12800的抗血清;依次用饱和硫酸铵沉淀法和DEAE-Sephadex A50柱层析对抗体进行分离纯化,获得分子量为35kDa的电泳纯多克隆抗体;该抗体与企鹅珍珠贝、马氏珠母贝（Pinctada martensii）、翡翠贻贝（Perna viridis）、扇贝（Chlamys farreri）、牡蛎（Crassostrea rivularis）Cd-MT具有较好的交叉免疫反应。3.企鹅珍珠贝Cd-MT间接非竞争ELISA检测方法的建立:通过优化,确定检测企鹅珍珠贝Cd-MT的间接非竞争ELISA法的最佳反应条件为:以生理盐水为包被液,于37℃包被2h;用2%的脱脂奶粉于37℃封闭30min;Cd-MT抗体最适浓度为25μg/mL,抗原与抗体作用时间为1h;酶标二抗的最适稀释度为1:4000,一抗与二抗作用时间为1h;显色时间为10min。在Cd-MT浓度为9.75～2×104ng/mL范围内,方法的回归方程y=0.1336Lnx+0.9693,R2=0.991,检出限为（4.563±0.051）ng/mL;批内相对标准偏差≤11.6%,批间相对标准偏差≤6.7%,回收率在83.7%～119.0%之间;用该方法对企鹅珍珠贝各组织器官MT粗提液中Cd-MT含量进行检测,得全脏器、鳃、闭壳肌、外套膜、内脏团MT粗提液中的Cd-MT含量依次为15.21、8.76、38.74、11.17、76.04ng/g,与各组织器官MT粗提液中的镉含量呈正相关。4.企鹅珍珠贝Cd-MT间接竞争ELISA法的建立及试剂盒的初步研究:建立了间接竞争ELISA方法,并在此基础上初步研制了检测企鹅珍珠贝Cd-MT的试剂盒。精密度和准确度实验表明:该方法的批内相对偏差≤8.7%,批间相对偏差≤5.2%,回收率在84.4%～132.8%之间,具有较好的稳定性和精确性。在Cd-MT浓度为3.9～2.0×103ng/mL的线性范围内,检出限为1.582ng/mL,抑制中点IC50为405.983ng/mL。保藏实验表明,该试剂盒在37℃下能保存7天,4℃可保存两个月。用此试剂盒对企鹅珍珠贝各组织器官MT粗提液中的Cd-MT含量进行检测,所得结果与间接非竞争ELISA法的检测结果相一致。本研究建立了检测企鹅珍珠贝Cd-MT含量的ELISA方法,也为水生环境中Cd的污染提供了一种快速简便的监测手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 重金属镉的污染状况
• 1.1.1 重金属镉的毒性
• 1.1.2 重金属镉的污染现状
• 1.2 贝类对重金属的富集
• 1.3 金属硫蛋白的理化性质、功能、诱导及分离纯化
• 1.3.1 MTs 的理化性质
• 1.3.2 MTs 的分类与结构组成
• 1.3.3 MTs 的功能
• 1.3.4 MTs 的诱导合成
• 1.3.5 MTs 的分离提取技术
• 1.4 MTs 检测方法的研究现状
• 1.4.1 金属亲和分析法
• 1.4.2 银染法
• 1.4.3 电化学法
• 1.4.4 色谱分析法
• 1.4.5 免疫法
• 1.3 研究内容、目的及意义
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 研究目的及意义
• 2 企鹅珍珠贝镉-金属硫蛋白的诱导、分离纯化及鉴定
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 企鹅珍珠贝Cd-MT 的诱导
• 2.2.2 MT 粗提液的制备
• 2.2.3 Cd-MT 的分离纯化
• 2.2.4 Cd-MT 亚型的分离纯化
• 2.2.5 Cd-MT 的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 MT 粗提液的制备
• 2.3.2 凝胶过滤层析洗脱曲线
• 2.3.3 企鹅珍珠贝Cd-MT 的诱导效果
• 2.3.4 离子交换层析洗脱曲线
• 2.3.5 脱金属试验
• 2.3.6 Cd-MT 的分子量
• 2.3.7 Cd-MT 的等电点
• 2.3.8 Cd-MT 的巯基含量
• 2.4 本章小结
• 3 企鹅珍珠贝镉-金属硫蛋白多克隆抗体的制备
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 Cd-MT 的偶联
• 3.2.2 抗原的乳化
• 3.2.3 抗血清的制备
• 3.2.4 抗血清效价的测定
• 3.2.5 抗体的分离与纯化
• 3.2.6 抗体纯度的鉴定
• 3.2.7 交叉反应试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Cd-MT 的偶联
• 3.3.2 抗血清效价的测定
• 3.3.3 抗体的纯化
• 3.3.4 交叉反应结果
• 3.4 本章小结
• 4 企鹅珍珠贝镉-金属硫蛋白间接非竞争ELISA 检测方法的建立
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.2 方法与步骤
• 4.2.1 间接非竞争ELISA 法的建立
• 4.2.2 精密度和准确度实验
• 4.2.3 企鹅珍珠贝样品的检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 间接非竞争ELISA 法条件的优化
• 4.3.2 间接非竞争ELISA 法标准曲线
• 4.3.3 方法的精密度和准确度
• 4.3.4 样品的检测
• 4.4 本章小结
• 5 间接竞争ELISA 检测方法的建立及试剂盒的初步研究
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.2 方法与步骤
• 5.2.1 间接竞争ELISA 检测方法的建立
• 5.2.2 试剂盒的组装
• 5.2.3 精密度与准确度实验
• 5.2.4 试剂盒的保藏实验
• 5.2.5 企鹅珍珠贝样品的检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 间接竞争ELISA 法条件的优化
• 5.3.2 间接竞争ELISA 法标准曲线
• 5.3.3 检测方法的精密度与准确度
• 5.3.4 试剂盒的保藏实验结果
• 5.3.5 企鹅珍珠贝样品的检测
• 5.4 本章小结
• 6 论文总结与展望
• 6.1 总结论
• 6.2 本文创新之处
• 6.3 本论文的欠缺之处及展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介