福建色素红曲去桔霉素毒素的菌种改造

论文摘要

以福建色素红曲MQ-01为出发菌株,采用改良的CTAB法提取其基因组DNA。根据Genebank公布的Monascus purpureus合成桔霉素的关键酶编码基因的DNA序列为基础,设计引物,并以红曲菌株MQ-01基因组DNA为模板,通过PCR扩增出合成桔霉素的关键酶的编码基因。将合成桔霉素关键酶的编码基因的DNA插入到质粒pBluescript sk（+）中,转化到E.coli DH5a中,并对转化子DNA测序。结果显示,此DNA序列正是合成桔霉素关键酶的编码基因DNA序列。将已构建的载体通过酶切,与pCSN43的trpC基因启动子和Hygromycin B（潮霉素B）抗性基因hph序列连接,并转化到JM109中。制备红曲菌株MQ-01的原生质体,然后通过限制性内切酶介导转化,通过潮霉素B抗性筛选出转化子,得到改造菌株MN-02。为了比较原始菌株MQ-01和改造菌株MN-02的产色素水平和桔霉素含量,本试验采用固体培养和液体发酵两种方法进行培养后,检测其产色素水平和桔霉素含量。结果显示：与原始菌株MQ-01的相比,改造菌株MN-02采用两种不同的方法培养,其产红曲色素色价水平没有降低,还略有提高。固体发酵色价提高了30.5 U/g,提高率4.05%,液体发酵色价提高率17.85 U/g,提高了10.53%。原始菌株MQ-01固态培养桔霉素含量为32.875μg/g,液态发酵桔霉素含量为20.25μg/ml;而改造菌株MN-02采用两种不同的培养方法,在本试验的条件下桔霉素均未检出。因此本研究得到了高产色素低产甚至不产桔霉素的安全菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 绪论
• 1.1 红曲概述
• 1.1.1 红曲霉和红曲简介
• 1.1.2 红曲霉的次生代谢产物
• 1.2 红曲霉产品中桔霉素的问题及其解决途径
• 1.2.1 桔霉素（citrinin）
• 1.2.2 桔霉素合成相关基因的探究
• 1.2.3 桔霉素的检测方法
• 1.2.4 低桔霉素红曲霉菌株的选育
• 1.3 丝状真菌转化的方法
• 1.3.1 PEG介导原生质体的传统转化方法
• 1.3.2 电击转化法
• 1.3.3 农杆菌介导的转化（ATMT）法
• 1.3.4 限制性酶介导整合（REMI）的转化方法
• 1.3.5 基因枪法（Particle gun）
• 1.4 课题的研究的意义以及主要内容
• 第一章 桔霉素基因改造
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 菌株
• 1.2.2 主要试剂
• 1.2.3 主要培养基
• 1.2.4 主要仪器和设备
• 1.2.5 实验方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 红曲霉菌株MQ-01基因组DNA
• 1.3.2 桔霉素关键酶编码基因DNA的克隆
• 1.3.3 桔霉素克隆载体pBCTD的构建
• 1.3.4 桔霉素敲除载体（pBCTD762-9）的构建
• 1.4 小结
• 第二章 原生质体制备与限制性内切酶介导转化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要培养基
• 2.2.4 主要仪器和设备
• 2.2.5 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 酶解体系的选择
• 2.3.2 原生质体再生条件的选择
• 2.3.3 原生质体转化方法的建立
• 2.3.4 阳性转化子的筛选
• 2.4 小结
• 第三章 原始菌株MQ-01与改造菌株MN-02产红曲色素和桔霉素的比较
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要培养基
• 3.2.4 主要仪器设备
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 原始菌株MQ-01与改造菌株MN-02色价比较
• 3.3.2 原始菌株MQ-01与改造菌株MN-02产桔霉素的HPLC分析
• 3.4 小结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 主要工作总结
• 4.2 工作展望
• 附录1 英文缩写词表
• 附录2 红曲霉桔霉素编码基因核苷酸序列
• 附录3 pCSN43 trpC基因启动子和Hygromycin B抗性基因hph序列
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历