3,6’-二芥子酰基蔗糖促神经元再生和神经保护发挥抗抑郁作用的机制研究

论文摘要

3,6′-二芥子酰基蔗糖（3,6′-disinapoyl sucrose, DISS）是一种从中药远志中提取的新寡糖酯类化合物，课题组前期研究发现，该成分具有明确的抗抑郁作用，能明显改善抑郁模型小鼠行为学指标，可增强5-HT系统功能，并能够保护受损的神经细胞，对慢性应激大鼠HPA轴激素水平具有调节作用，增加抑郁动物海马中磷酸化CREB表达，并提高CREB下游靶基因BDNF的mRNA及蛋白的表达。本课题主要以神经元再生与保护为切入点，聚焦于神经营养通路中的关键靶点CREB，针对其调节的上下游通路（细胞生存与凋亡、细胞氧化应激），围绕DISS参与的促神经元再生和神经营养保护作用通道进行研究，旨在深入探讨DISS通过促进神经元再生和神经保护发挥抗抑郁的细胞分子机制，希望发现其可能作用的具体靶点或参与调节的信号传递途径，对同类新型抗抑郁剂的研发及抑郁症发病机理的认识做出有益探索。DISS对CREB磷酸化通路调节下游凋亡靶基因，参与神经细胞生存与凋亡的影响采用体外培养人神经母细胞瘤株（SH-SY5Y细胞），用MTT法筛选Glu致细胞损伤的最佳浓度，在建立损伤细胞模型的基础上，用MTT法测定DISS对细胞存活率的影响及乳酸脱氢酶（LDH）含量；流式细胞仪PI染色测定细胞凋亡比率；Real-time PCR技术测定促凋亡基因bax，抗凋亡基因bcl-2 mRNA的相对表达。研究发现，与Glu损伤后的模型组相比，DISS可以提高细胞存活率，减少LDH的释放，降低细胞凋亡比率，下调bax mRNA表达，升高bcl-2 mRNA表达；提示DISS可能参与细胞凋亡基因的调节，抑制细胞凋亡促进神经细胞再生。DISS对CREB磷酸化下游通路调节，参与神经细胞氧化应激的影响筛选H2O2最佳损伤浓度，确定最佳损伤浓度为300μM，干预0.5h后加入终浓度为0.6，6，60μMDISS继续培养12h结束培养，测定细胞存活率，超声裂解细胞测定细胞内SOD，MDA，CAT，GSH-PX的含量。研究表明，与H2O2组比较，终浓度为0.6，6，60μM的DISS能减轻H2O2引起的SH-SY5Y神经细胞的损伤，且呈现剂量依赖趋势，能明显提高细胞的存活率，升高SOD，CAT，GSH-PX的含量，降低MDA含量。该结果提示提高机体抗氧化能力和清除自由基能力参与细胞氧化应激的调节，可能是DISS促神经再生和保护的另一途径作用。DISS对CREB磷酸化上游信号通路关键靶点的影响采用Western-blot检测技术，分别对CREB上游三条通路中的关键蛋白进行拮抗后Glu损伤，给予DISS保护，检测末端蛋白CREB和pCEEB拮抗前后表达差异。H89为PKA拮抗剂，拮抗后末端蛋白表达变化不明显，推测DISS神经保护作用与AC/cAMP/PKA通路关联不明显。U0126为MEK拮抗剂，拮抗后CREB和pCREB表达变化明显，据此推测DISS作用与MEK/ERK/RSK通路有关。KN93为CaMK拮抗剂，拮抗后CREB和pCREB表达有明显差异，推测DISS作用与Ca2+/CaM/CaMK通路有关。综上所述，DISS可能通过（MAPK）通路和钙调蛋白激酶（CaMK）通路激活CREB，磷酸化后的CREB可以进一步促进抗凋亡基因bcl-2的表达，抑制凋亡基因bax的表达，促进神经细胞再生并抑制其凋亡；同时，DISS促进CREB磷酸化后的启动了下游氧化应激的通路，通过上述转导通路系统，DISS最终影响神经细胞的神经可塑性、神经分化、神经营养、细胞生存与凋亡、细胞氧化应激功能等，发挥抗抑郁作用。

论文目录

• 缩略语说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 DISS 对GLU 损伤抗调亡作用机制研究
• 1.1 实验仪器设备与试剂材料
• 1.1.1 仪器与设备
• 1.1.2 试剂和材料
• 1.1.3 细胞株
• 1.2 SH-SY5Y 细胞的培养
• 1.2.1 各药液的配制
• 1.2.2 细胞的培养及传代
• 1.3 MTT 法测定DISS 对Glu 损伤的百分存活率
• 1.3.1 筛选Glu 损伤最佳浓度
• 1.3.2 筛选Glu 损伤时间
• 1.3.3 细胞形态观察
• 1.3.4 DISS 对Glu 损伤的细胞存活率的影响
• 1.4 细胞培养基中LDH 含量测定
• 1.5 DISS 对Glu 损伤细胞周期的改变
• 1.6 Real-time PCR 检测bax，bcl-2 mRNA 表达改变
• 1.6.1 细胞总RNA 的提取
• 1.6.2 RNA 纯度及浓度测定
• 1.6.3 RNA 逆转录成cDNA
• 1.6.4 Real-time PCR 扩增反应
• 1.7 统计学方法
• 1.8 结果
• 1.8.1 Glu 最佳损伤浓度
• 1.8.2 Glu 损伤作用时间筛选
• 1.8.3 DISS 对Glu 损伤的细胞形态的改变
• 1.8.4 DISS 对Glu 损伤的细胞存活率的改变
• 1.8.5 DISS 对Glu 损伤细胞模型LDH 活性的影响
• 1.8.6 流式检测DISS 对细胞调亡的保护作用
• 1.8.7 DISS 对bax,bcl-2 mRNA 表达的影响
• 1.9 讨论
• 第二章 DISS 对氧化损伤细胞的保护作用
• 2.1 实验试剂及仪器
• 2.2 细胞培养方法
• 2O₂ 最佳损伤浓度'>2.3 筛选H₂O₂最佳损伤浓度
• 2O₂ 损伤的保护作用细胞存活率的影响'>2.4 DISS 对H₂O₂损伤的保护作用细胞存活率的影响
• 2.5 细胞内SOD，MDA，CAT，GSH-PX 各指标的测定
• 2.5.1 SOD 含量的测定
• 2.5.2 MDA 含量的测定
• 2.5.3 CAT 含量的测定
• 2.5.4 GSH-PX 的测定
• 2.6 统计学方法
• 2.7 结果
• 2O₂ 损伤条件的筛选'>2.7.1 不同时间和浓度的H₂O₂损伤条件的筛选
• 2O₂ 损伤的细胞存活率的改变'>2.7.2 DISS 对H₂O₂损伤的细胞存活率的改变
• 2.7.3 DISS 对细胞内氧化应激各项指标的影响
• 2.8 讨论
• 第三章 DISDISS 保护作用相关机制初步研究
• 3.1 实验仪器设备与试剂材料
• 3.1.1 Western-blot 相关试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 蛋白提取及浓度测定
• 3.3 Western-blot 过程
• 3.3.1 所需准备试剂
• 3.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳过程
• 3.3.3 转膜
• 3.3.4 抗原抗体结合反应
• 3.3.5 化学发光
• 3.3.6 凝胶图象分析
• 3.4 结果
• 3.5 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢