副猪嗜血杆菌的分离鉴定及蜂胶疫苗的免疫保护效力研究

论文摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪上呼吸道的一种共栖菌,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属。它可在特定条件下侵入机体,引起猪的纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎为特征的全身性细菌疾病。目前该病已经成为全球养猪业影响最为严重的细菌性传染病之一,且发病率和死亡率也呈显著上升趋势,给我国的养猪业也造成严重的经济损失。本研究进行了细菌的分离鉴定以及间接ELISA检测抗体方法的建立和蜂胶疫苗的免疫原性研究。主要研究结果如下：1.本研究从四川省某几个规模化养猪场患多发性浆膜炎和关节炎的病猪分离到副猪嗜血杆菌,对其进行培养特性、形态结构、生化特性的鉴定,结果显示,该分离菌株在普通琼脂平板、麦康凯培养基中未见生长,在鲜血琼脂平板、巧克力平板上生长不好,在TSA平板、NAD鲜血琼脂平板上生长良好。说明该菌株是NAD依赖菌,革兰氏染色镜检结果该菌株为革兰氏阴性菌,菌体形态多样,有丝状、短杆状甚至球状,符合副猪嗜血杆菌的基本特征；并根据副猪嗜血杆菌的16SrRNA序列设计引物对分离菌株进行PCR的扩增,进一步证实了该分离菌株为副猪嗜血杆菌。该结果表明,四川省某地区存在HPS的流行。2.对该分离菌株进行药敏试验,并对其血清型进行鉴定。药敏试验结果显示,该分离菌株对庆大霉素、恩若沙星、复方新诺明、青霉素耐受,对先锋霉素IV、头孢噻肟、舒巴坦、痢特灵、氯霉素等高度敏感。将该分离菌株制成生理盐水细菌悬液,按照副猪嗜血杆菌标准血清试剂盒说明书方法进行检测。结果该分离菌株与HPS5型阳性血清凝集反应明显,形成白色片状凝集物,而与其他标准阳性血清和生理盐水无凝集现象,表明该分离株为副猪嗜血杆菌5型命名为SCHPS5。3.通过对SCHPS5生长曲线的研究,表明了该菌在TSB液体培养基中4h左右开始缓慢生长,在16-18h之间生长最好,随着时间的延长,OD600开始逐渐下降,在24h左右OD600有上升趋势,以后再次下降。本试验为副猪嗜血杆菌灭活疫苗制备的最佳时机提供了一个依据。4.本试验利用超声波破碎的副猪嗜血杆菌分离株全菌体上清液作为抗原,通过阳性血清的制备、包被原浓度、二抗浓度、反应时间等条件优化和敏感性试验、特异性试验与重复性试验,对副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法进行了优化研究,建立了检测HPS抗体的间接ELISA方法。经试验确定了HPS全菌体的包被浓度作1：100稀释,血清作1：160稀释,以及HPS间接ELISA反应条件的优化。以该分离株建立的抗体检测间接ELISA方法的抗体检测敏感性可达到1：10000以上,并且具有良好的特异性和重复性。5.本试验通过对副猪嗜血杆菌蜂胶疫苗的制备,对其安全性进行检测,检测安全后对怀孕母猪产前2周肌肉注射疫苗,观察其产仔猪的母源抗体水平。并对新生仔猪进行疫苗免疫,并于免疫后第1、7、14、21、30、35、40、45天采血分离血清,检测新生仔猪在免疫后的血清抗体水平。结果表明,通过对怀孕母猪产前免疫可以为新生仔猪提供较高的母源抗体,但是仔猪在哺乳阶段未接受免疫,其体内的母源抗体在断奶后很快就会消失,而对新生仔猪免疫可以使仔猪在断奶后仍然保持有较高的血清抗体水平。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbrevintion）
• 第一章 文献综述
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 主要毒力因子
• 3.1 荚膜
• 3.2 脂多糖
• 3.3 菌毛
• 3.4 外膜蛋白
• 3.5 转铁结合蛋白
• 3.6 神经氨酸酶
• 4 致病机理
• 5 临床症状及病理变化
• 6 诊断
• 6.1 病原学诊断
• 6.2 免疫学诊断
• 7 防制
• 第二章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
• 1 材料
• 1.1 病料来源
• 1.2 主要试验仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要培养基及配制
• 1.5 主要溶液的配制
• 1.6 引物设计
• 1.7 卫星现象检查用菌种
• 2 试验方法
• 2.1 病原菌的分离
• 2.2 涂片镜检
• 2.3 细菌的菌落形态及染色观察
• 2.4 卫星试验
• 2.5 生化试验
• 2.6 PCR检测
• 2.7 琼脂糖凝胶电泳及检测
• 2.8 药敏试验
• 2.9 动物试验
• 2.10 血清型鉴定
• 3 试验结果与分析
• 3.1 细菌的分离培养
• 3.2 细菌形态及菌落特征
• 3.3 卫星试验结果
• 3.4 生化试验
• 3.5 PCR鉴定
• 3.6 药敏试验
• 3.7 动物试验
• 3.8 血清型
• 4 讨论
• 第三章 副猪嗜血杆菌分离株的生长特性的测定
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要药品
• 1.3 主要培养基的配制
• 1.4 主要试验仪器
• 2 试验方法
• 2.1 菌株的复壮培养
• 2.2 生长曲线的测定
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 副猪嗜血杆菌间接ELISA方法检测抗体的建立
• 1 试验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要培养基的配制
• 1.4 主要试验仪器
• 1.5 所需溶液的制备
• 2 试验方法
• 2.1 血清的制备
• 2.2 包被抗原的制备
• 2.3 间接ELISA方法操作
• 2.4 ELISA反应条件的确定
• 2.5 敏感性试验
• 2.6 特异性试验
• 2.7 重复性试验
• 2.8 临床应用
• 3 结果与分析
• 3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
• 3.2 酶标二抗最佳稀释度的确定
• 3.3 抗原最佳包被时间的确定
• 3.4 封闭条件的确定
• 3.5 抗原抗体最佳作用时间
• 3.6 酶标二抗作用时间的确定
• 3.7 底物最佳显色时间
• 3.8 阴阳判定标准的确定
• 3.9 敏感性试验
• 3.10 特异性试验
• 3.11 重复性试验
• 3.12 临床试验结果
• 4 讨论
• 第五章 副猪嗜血杆菌蜂胶灭活苗的免疫效力研究
• 1 试验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要培养基的配制
• 1.5 试验动物
• 2 试验方法
• 2.1 菌株的复壮培养
• 2.2 疫苗的制备
• 2.3 疫苗的安全性检测
• 2.4 免疫试验Ⅰ
• 2.5 免疫试验Ⅱ
• 3 结果与分析
• 3.1 疫苗的安全性检测
• 3.2 攻毒保护试验
• 3.3 排菌时间的测定
• 3.4 母源抗体消长规律
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢