海马神经元雄激素膜受体的定位及其快速作用

论文摘要

目的：以原代培养海马神经元为研究对象，观察睾酮-牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素（T-BSA-FITC）与海马神经元胞膜结合情况，验证海马神经元细胞膜雄激素特异性结合位点（膜受体）的存在；研究睾酮对原代培养海马神经元Ca2+和钙调蛋白（CaM）的快速作用，为海马神经元雄激素膜受体介导的非基因组作用研究提供实验依据。方法：1、原代海马神经元培养、形态观察及鉴定：新生1d内SD大鼠乳鼠，无菌条件下断头取脑，剥离海马，去除血管和软脑膜，剪碎海马组织，胰酶消化。DMEM（10%NBCS）终止消化。机械性分散成单细胞悬液，以5～10×105/ml密度接种于包被有多聚赖氨酸的培养板上。细胞在CO2培养箱内孵育，培养24h内，更换培养基为含L-谷氨酰胺和2%B27的Neurobasal。MTT法绘制细胞生长曲线，细胞免疫荧光化学方法鉴定神经元及其纯度。2、海马神经元雄激素膜受体定位研究：取培养8～10天的原代海马神经元，加入T-BSA-FITC37°C作用15min，激光共聚焦显微镜下观察雄激素复合物的亚细胞定位。BSA-FITC作为阴性对照组。另设竞争性实验，用过量游离T提前作用神经元15min后再加入T-BSA-FITC继续作用15min，观察T-BSA-FITC与胞膜结合情况，验证海马神经元是否存在雄激素膜受体。3、研究雄激素对海马神经元Ca2+的快速作用：Ca2+敏感荧光染料Fluo4-AM对原代培养海马神经元进行负载，激光共聚焦显微镜记录10-7MT干预前后细胞内Ca2+的变化。每隔2s记录一次，共记录30min。4、研究雄激素对海马神经元CaM的快速作用：应用免疫荧光细胞化学技术观察10-7M T作用于海马神经元0min、15min、30min、1h和2h CaM的表达情况。结果：1、原代海马神经元培养，6～8h开始贴壁，培养24h后大部分神经元贴壁并伸出突起，培养3d神经元突起增多并延长。随着培养时间延长，胞体增大，丰满，突起进一步增粗延长，交织成网络。细胞呈多极神经元，形态多样，有锥形、三角形、梭形、椭圆形等等。培养3w后，细胞开始退化，胞质中出现颗粒空泡，突起退化、核固缩崩解。MTT法绘制生长曲线：潜伏生长期（2～4d）,生长期（4～10d），此时细胞生长较快，发育成熟，之后处于达到平稳状态（11d～）。经NeuN免疫细胞化学染色，Hoechst33258复染细胞核，证明是神经元，计数阳性细胞率大于95%。2、海马神经元雄激素膜受体定位研究结果：T-BSA-FITC组，部分神经元胞膜上有特异性荧光，其神经突起起始部亦有荧光，而内部无特异性标记。在同样孵育条件下BSA-FITC没有结合到神经元上。游离T预先孵育几乎未检测到任何荧光染色，表明T预先孵育可以完全阻断T-BSA-FITC膜结合作用。3、雄激素对海马神经元Ca2+的快速作用研究结果：原代海马神经元Fluo4-AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜下给予T处理，部分神经元在给药后数分钟内细胞内钙有增高，并可诱发出细胞内钙波动，峰值较基础值增高3.45±0.20倍，且峰值出现在给药后20min内。4、雄激素对海马神经元CaM的快速作用研究结果：T干预各时间组CaM荧光强度较0min组（46.49±1.15）均增加（P<0.05）。其中15min组（101.74±2.88）和30min组（103.27±2.80）荧光强度增加明显；1h组（85.10±2.23）和2h（81.65±1.68）组荧光强度增加程度弱于15min组和30min组（P<0.05）。结论:1、出生24h以内的SD大鼠乳鼠，体外无血清培养技术可以成功培养出原代海马神经元，经鉴定细胞纯度达到95%以上，培养8～10d可用于实验。2、海马神经元细胞膜存在睾酮特异性结合位点（膜受体），且该位点可以被游离T竞争性结合。3、T作用于原代培养海马神经元可以引起部分细胞内Ca2+和CaM的快速变化，其作用可能是通过雄激素膜受体介导的快速非基因组效应实现的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 雄激素快速作用的非基因组效应研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历