STAT3活化介导肝细胞癌上皮间质转化机制研究

论文摘要

目的：1、观察肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌）组织中活化形式（磷酸化）的信号转导及转录活化子3 （phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3, p-STAT3）、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）主要标志物的表达情况及其临床意义；2、细胞学实验体外探讨调控STAT3活化水平对肝癌细胞EMT的影响及其可能的分子机制；3、动物实验体内探讨抑制STAT3活化水平对肝癌细胞EMT的影响及其可能的分子机制；4、荟萃（meta）分析评价临床使用的具有STAT3活化抑制作用的干扰素-a（interferon-a, IFN-a）在预防肝癌根治性治疗术后复发及改善病人生存方面的疗效。方法：1、采用免疫组织化学方法检测了100例肝癌及10例正常肝组织标本中p-STAT3、EMT标志物（上皮标志物E-cadherin、间质标志物vimentin）表达,分析所检测指标之间及其与肝癌侵袭转移的相关性;2、采用不同转移潜能的肝癌细胞株（SMMC7721、HepG2、HCC97L、MHCC97H、HCCLM3）, transwell侵袭实验检测肝癌细胞体外侵袭力、RT-PCR及Western-blot检测其STAT3、p-STAT3表达,筛选出低侵袭、低P-STAT3表达及高侵袭、高p-STAT3表达水平的2株具有代表性的肝癌细胞,利用表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）诱导肝癌细胞STAT3（?）舌化及STAT3磷酸化抑制剂JSI-124抑制STAT3活化水平；观察调控STAT3活化对肝癌细胞形态学的影响,共聚焦显微镜观察FITC-Phalloidin（鬼笔环肽）标记的F-actin细胞骨架变化,RT-PCR、Western-blot及免疫荧光染色检测EMT分子标志物（E-cadherin、vimentin）及转录因子Twist表达变化,transwell侵袭、细胞伤口愈合实验检测细胞体外侵袭迁移力的变化；3、建立裸鼠皮下种植性肝癌自发性肺转移模型,采用JSI-124腹腔注射,观察抑制STAT3活化对肝癌皮下移植瘤生长、转移的影响,RT-PCR、Western-blot及免疫组化染色检测EMT分子标志物（E-cadherin、vimentin）及Twist表达变化；4、采用meta分析方法对临床使用的具有STAT3活化抑制作用的IFN-a在预防肝癌治愈性切除或消融治疗术后复发及改善病人生存方面的作用进行系统评价。结果：1、免疫组化检测发现肝癌组织中P-STAT3、vimentin表达较正常肝组织明显升高而E-cadherin表达降低,E-cadherin、vimentin表达呈负相关,P-STAT3与vimentin表达呈正相关、而与E-cadherin表达呈负相关：此外,p-STAT3、E-cadherin及vimentin表达均与肝癌侵袭转移有关；这提示肝癌中存在EMT现象,而STAT3活化可能通过介导EMT、促进肝癌侵袭转移。2、transwell侵袭实验、RT-PCR及Western-blot检测结果提示SMMC7721细胞为具有低侵袭力、低p-STAT3表达水平的代表性细胞株,HCCLM3细胞为具有高侵袭力、高p-STAT3表达水平的代表性细胞株；故本研究中采用SMMC7721、HCCLM3作为实验对象。研究结果如下：（1）EGF处理SMMC7721细胞24小时后,细胞呈梭形、纺锤样形态,细胞间隙增宽,F-actin细胞骨架发生重排而对照组细胞却呈典型的上皮样表型,在合并使用JSI-124的情况下,部分细胞仍维持明显的上皮样形态；这初步提示EGF诱导的STAT3活化可能介导了肝癌细胞EMT。（2）通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光染色方法进一步检测了改变STAT3活化水平后肝癌细胞EMT分子标志物表达的变化,结果发现EGF处理SMMC7721细胞后,E-cadherin表达降低而vimentin表达升高,合并使用JSI-124却能够部分阻断上述效应的发生,JSI-124处理HCCLM3细胞后其E-cadherin表达升高而vimentin表达降低。（3）细胞侵袭和伤口愈合实验结果显示,EGF处理SMMC7721后,细胞的侵袭迁移能力明显高于对照组,而在联合应用JSI-124的情况下,这种变化却能够部分被抑制,JSI-124处理HCCLM3细胞后其侵袭迁移能力亦明显下降。（4）进一步通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光染色方法检测了调节STAT3活化水平对肝癌细胞Twist表达的变化,结果表明EGF处理SMMC7721细胞后,Twist表达显著升高,合并使用JSI-124却能够部分阻断上述变化,JSI-124处理HCCLM3细胞后其Twist表达明显降低。综合以上结果,表明：STAT3活化介导了肝癌细胞EMT发生,而Twist可能在此过程中起重要作用。3、裸鼠体内实验表明：与对照组相比,JSI-124能显著抑制HCCLM3肝癌皮下移植瘤生长并抑制其肺转移；采用RT-PCR、Western-blot及免疫组化检测发现JSI-124治疗组肿瘤组织P-STAT3降低E-cadherin表达升高而vimentin表达降低,此外,JSI-124处理后Twist表达明显降低；提示：抑制STAT3活化能抑制或部分抑制EMT而降低肝癌转移,这同时也验证了体外实验结果。4、meta分析结果提示IFN-a能显著的降低肝癌治愈性切除或消融术后早期复发、提高肝癌病人存活率；这预示着STAT3抑制剂用于肝癌的临床干预治疗具有潜在的价值。结论：1、人肝癌组织中存在STAT3活化及EMT现象,且与肝癌侵袭转移相关;p-STAT3/ E-cadherin信号轴可作为肝癌侵袭转移潜能预测指标：2.STAT3活化能通过介导肝癌细胞EMT、促进肝癌侵袭转移,其分子机制可能涉及转录因子Twist；3.IFN-a能有效降低肝癌治愈性治疗术后早期复发并改善病人预后。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、磷酸化STAT3、上皮性标志物、间质性标志物在肝癌组织中的表达及与侵袭转移的相关性
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 p-STAT3在肝癌组织及正常肝组织中的表达
• 1.2.2 E-cadherin、vimentin在肝癌组织及正常肝组织中的表达
• 1.2.3 p-STAT3、E-cadherin、vimentin在肝癌组织中表达及与侵袭转移的相关性
• 1.3 讨论
• 1.3.1 STAT3活化在肝癌侵袭转移中的作用
• 1.3.2 E-cadherin、vimentin在肝癌侵袭转移中的作用
• 1.3.3 p-STAT3、E-cadherin、vimentin在肝癌中表达的相关性
• 1.4 小结
• 二、STAT3活化介导肝癌细胞上皮间质转化及其分子机制初步研究
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 肝癌细胞单层（二维）培养形态学
• 2.2.2 肝癌细胞体外侵袭力比较
• 2.2.3 肝癌细胞STAT3及其活化水平比较
• 2.2.4 肝癌细胞株的选择及实验分组
• 2.2.5 EGF对肝癌细胞STAT3活化诱导及JSI-124对STAT3活化抑制作用的检测
• 2.2.6 二维培养及HE染色观察肝癌细胞形态学变化
• 2.2.7 三维培养观察肝癌细胞形态学变化
• 2.2.8 共聚焦显微镜观察肝癌细胞细胞骨架变化
• 2.2.9 RT-PCR、Western-blot检测肝癌细胞EMT分子标志物表达变化（半定量分析）
• 2.2.10 免疫荧光染色检测肝癌细胞EMT分子标志物表达变化（定位分析）
• 2.2.11 RT-PCR、Western-blot检测诱导EMT的关键转录因子Twist在肝癌细胞表达变化（半定量分析）
• 2.2.12 免疫荧光染色检测肝癌细胞Twist表达变化（定位分析）
• 2.2.13 transwell侵袭实验检测肝癌细胞EMT相关的侵袭力变化
• 2.2.14 伤口愈合实验检测肝癌细胞EMT相关的迁移力变化
• 2.3 讨论
• 2.3.1 STAT3活化与肝癌EMT
• 2.3.2 Twist与肝癌EMT及STAT3活化
• 2.3.3 STAT3活化介导的EMT与肝癌的侵袭迁移
• 2.4 小结
• 三、STAT3活化介导肝癌细胞上皮间质转化的动物实验研究
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 JSI-124对人肝癌裸鼠皮下移植肿瘤生长、增殖的影响
• 3.2.2 JSI-124对人肝癌裸鼠皮下移植肿瘤肺转移的影响
• 3.2.3 JSI-124对人肝癌裸鼠皮下移植肿瘤STAT3及p-STAT3表达的影响
• 3.2.4 JSI-124对人肝癌裸鼠皮下移植肿瘤EMT分子标志物表达的影响
• 3.2.5 JSI-124对人肝癌裸鼠皮下移植肿瘤诱导EMT关键转录因子Twist表达的影响
• 3.2.6 JSI-124对人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型荷瘤裸鼠生存的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 四、干扰素-α对肝癌治愈性治疗术后复发、生存影响的临床循证医学证据评价
• 4.1 对象和方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 文献的选择及其特点
• 4.2.2 meta分析结果
• 4.2.3 敏感性分析与发表偏移
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述1 信号传导与转录活化子3与肿瘤侵袭转移及靶向治疗
• 综述参考文献
• 综述2 上皮细胞间质转化与肿瘤侵袭转移及其调控机制
• 综述参考文献
• 致谢