论文摘要
目的由于生物体内广泛存在具有手性识别能力的生物大分子,当手性药物与其相互作用时将产生不同的立体选择性,从而体现不同的药代动力学和药效学特征。因此手性药物对映体在生物体内的行为差异性研究有着重要的意义。药物动力学研究中,涵盖着吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）和排泄（Excretion）四个过程。吸收过程和排泄过程的研究对药物动力学而言至关重要。近年来,通过肠上皮细胞的培养作为研究药物吸收、代谢机制的体外模型取得令人鼓舞的进展。最具代表性的细胞是来自结肠癌细胞系的Caco-2（The human colon carcinoma cell line,Caco-2）细胞。Caco-2细胞单层模型可以在细胞水平提供关于药物分子通过小肠黏膜吸收、代谢、转运的信息,其结果与口服药物的体内小肠上皮细胞吸收过程有良好的相关性。因此作为本论文研究的吸收模型。普萘洛尔（Propranolol,PRO）是含有一个手性中心的手性药物,在临床上广泛应用的是其外消旋体。研究表明,PRO具有显著的手性药理学特征,是一种具有代表性的手性药物。而且,目前从手性角度来研究Caco-2细胞模型对于普萘洛尔异构体的转运特征还未见报道。因此,本研究选用PRO作为模型手性药物,建立并应用Caco-2细胞单层模型,研究手性药物的吸收动力学特性。方法将药物溶液分别加在Caco-2细胞单层膜的基底面一侧（Basolateral, BL）或绒毛面一侧（Apical,AP）,从两个方向考察药物的转运,在不同的时间从两个方向取样,用手性衍生化反相色谱法（RP-HPLC）,测定药物在不同时间的浓度,采用外标法进行定量。细胞模型建立、评价:Caco-2细胞用内含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2、湿度为90%的环境中培养,当细胞融合后,用胰酶-EDTA液消化,将细胞按5.67×105cells/mL接种于Millicell（?）细胞培养池（0.4mL/孔）,培养池下腔加入培养基0.6mL。第一周隔天换液,一周以后每天换液。培养2125天后,以细胞单层跨膜电阻（Transepithelial electrical resistance,TEER）、标志物的表观通透系数（The apparent permeability coefficients,Papp）和形态学三个指标评价Caco-2细胞单层模型的完整性。色谱条件:色谱柱:Shimadzu Vp-ODS C18（4.6×150mm i.d,5μm,日本岛津）;流动相:甲醇-20 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液（75:25）;紫外检测波长:220 nm,流速:1 mL·min-1;柱温:室温;进样量:20μL。样品衍生化制备方法:取各样品溶液150μL减压干燥后,加入20μL甲醇和400μL GITC溶液（浓度为480μmol/L）,涡旋混合1 min后, 80℃反应50min,在45℃条件下氮气吹干,加入100μL甲醇使溶解,涡旋混合1 min,以转速为5000转/分离心10分钟,取上清液作为样品溶液。结果Caco-2细胞经21-25天培养,形态学观察可见细胞融合形成连续、完整的单细胞层,细胞表面覆盖一层刷状缘微绒毛,此时Papp < 1.0×10-6cm/s,TEER>200Ω×cm2。说明Caco-2细胞膜具有良好的完整性,可用于药物吸收动力学研究。应用Caco-2细胞单层模型进行的普萘洛尔异构体吸收动力学研究表明,在20-240μmol·L-1的浓度范围内,Pro的吸收无立体选择性。本研究所建立的PRO异构体手性色谱检测方法,在较宽的范围内线性关系好,相关系数>0.9998以上。方法精密度（RSD）不大于15%,回收率在94%110%间。S/R- PRO检测限为0.1μmol·L-1。结论本研究建立了Caco-2细胞单层模型,并进行了完整性评价,表明所建立的Caco-2细胞单层模型可应用于药物转运研究。应用所建立的Caco-2细胞单层模型进行了PRO异构体吸收动力学研究,结果表明,亲脂性药物PRO的吸收主要以被动扩散为主,无立体选择性。另外,本研究还建立了柱前衍生化RP-HPLC法检测普萘洛尔对映异构体浓度,该方法可在20 min内分离测定PRO异构体,方法操作简便、精密度好、结果准确可靠。