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利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花

2020-12-07阅读(839)

利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花

论文摘要

菊花是我国的传统名花,深受人们喜爱。为了使菊花满足周年生产的需求,花期调控逐渐成为目前育种研究的一个重要方面。LFY基因是控制花分生组织形成的基因,在植物成花过程中具有重要的作用,它不仅决定着植物由营养生长向生殖生长的转变,且其超量表达可以使植物的花期提前,因此利用基因工程技术导入LFY基因试图改变菊花的花期,但是在遗传转化过程中,使用的标记基因会产生潜在的生态环境和食用安全性问题,因此培育不含选择标记的转基因植物已成为基因工程育种的重要目标和发展趋势。利用共转化法去除选择标记基因简单有效,通过后代的分离可以筛选到只含有目的基因,不含标记基因的植株。因此在传统转基因中发展起来的去除标记基因的安全转基因技术日益受到重视,成为目前研究的热点。本研究首次关注转基因观赏植物的安全性,旨在获得不含标记基因的转基因菊花,减轻对其安全性的顾虑。通过构建一个双T-DNA表达载体,用农杆菌介导转化菊花,建立遗传转化体系,筛选不含标记基因的转化植株,并对基因定向叠加技术进行了探索。主要结果如下:1.构建了双T-DNA超级双元表达载体pCAMBIA1300-LFY-hpt克隆载体LFY-pBS上含有拟南芥LFY基因cDNA全长,用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切该载体,回收长约1.5 kb的LFY基因片段,用DNA聚合酶Klenow大片段将其补平后,连接在用XhoⅠ切除了hpt基因的pCAMBIA1300表达载体上,得到中间载体pCAMBIA1300-LFY。质粒pCAMBIA1300经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切补平自连后得到去除了多克隆位点的中间载体pCAMBIA1300-,再经SacⅡ/SphⅠ双酶切后插入到经SacⅡ酶切的pCAMBIA1300-LFY质粒中。构建成双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1300-LFY-hpt,经酶切鉴定证明了所构建载体的正确性。其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因LFY,通过液氮冻融法将重组载体导入农杆菌EHA105中。2.建立了地被菊‘七月桃花’和‘流金岁月’的遗传转化受体系统以MS为基本培养基,采用6-BA和NAA两种激素12种不同配比的组合,从10种地被菊品种中筛选和建立起‘七月桃花’和‘流金岁月’不定芽再生体系,结果表明,最佳培养基配方分别是MS+6-BA2 mg/L+NAA0.5 mg/L和MS+6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L,在该配比下‘七月桃花’和‘流金岁月’的再生率分别达到91.4%和89.5%。从方差分析的结果可以看出,不同水平的6-BA和NAA以及6-BA和NAA的交互作用对‘七月桃花’和‘流金岁月’再生频率的影响达到极显著水平。抗生素敏感性试验结果表明,8mg/L和10mg/L的潮霉素是‘七月桃花’转化细胞再生和生根筛选的临界浓度,在分化培养基和生根培养基中添加450mg/L和200mg/L的头孢霉素能够有效抑制农杆菌的生长。通过研究预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度对转化效率的影响,建立和优化了‘七月桃花’的遗传转化受体系统为:以预培养12 h的叶片为转化材料,用浓度OD600为0.4的农杆菌菌液侵染15 min,黑暗条件下25℃共培养2 d,用无菌水漂洗3次,用灭菌滤纸吸干叶片表面的水分,接种到MS+6-BA 2mg/L+NAA0.5 mg/L+8 mg/L潮霉素+450 mg/L头孢霉素的分化筛选培养基中进行筛选培养,每20 d转接到新鲜的筛选培养基中,待抗性芽生长到1 cm左右时,将其切下转接到1/2MS+10 mg/L潮霉素+200 mg/L头孢霉素的生根筛选培养基中,转化植株约在15 d后开始生根,30 d左右生长为完整的植株。3.筛选获得了不含选择标记基因,并使花期提前的菊花品系在5次独立实验中一共使用了900个叶盘,经过遗传转化,首先在具有潮霉素的培养基上进行筛选,一共获得79个抗性植株,而进一步进行PCR的检测结果却表明只有68个潮霉素阳性植株,记为T0代,5次转化实验获得的最高转化效率为10.6%,平均转化效率为7.6%。通过对T0代的hpt和LFY基因的PCR扩增,结果表明有21个T0代植株发生了目的基因和标记基因的共转化,平均共转化率为2.3%。T0代共转化植株套袋自交获得T1代株系,T1代可以获得4种基因型,它们分别是hpt-/LFY-,hpt+/LFY+,hpt-/LFY+,hpt+/LFY-。随机选择17个T0代株系自交形成的T1代分析目的基因LFY与标记基因hpt的遗传分离规律,分别以hpt和LFY基因的引物扩增T1代基因组DNA,在所检测的后代中能获得51株基因型是hpt-/LFY+的植株,即转基因后代中不含hpt基因只含有目的基因LFY。获得无标记基因植株的平均频率是9.31%。随机选择8个T1代不含标记基因的植株自交,在T2代中筛选出不含标记基因的纯合株系。对T2代纯合株系的性状观察和分析结果表明,转基因植株在节间、株高、冠幅、花径上与对照无显著差异,而花期有变化,其中一个株系花期提前15天。4.构建了用于基因叠加的目标载体、重组载体和整合载体基因叠加技术是在特定位点插入第一个外源基因时,同时附带一个插入位点,这样在插入第二个基因时,能迅速与前一个基因后的插入位点识别并整合进去,依次叠加,可以获得在一个位点同时累积多个外源基因的转基因个体。特定位点的基因叠加技术不仅可以减少转基因的随机性,保证外源基因稳定高效表达,还可以多次利用同一特定插入位点,降低插入位点对外源基因的影响,并将多个优良性状逐个逐次累加到单一个体中实现优良品种中多个外源基因的高效叠加,以缩短新品种的研发和市场化时间。试验中构建了用于基因叠加的目标载体pARTOS1,利用农杆菌介导转化到烟草中,经过Southern杂交,获得了含有单拷贝的转基因株系,构建了含有PhiC31的重组酶载体和整合载体pARTOS2。本研究构建了双T-DNA表达载体并转化菊花,首先获得共转化植株,然后通过对自交后代的筛选,获得了能使花期提前15天,并且不含有选择标记的转基因菊花,有利于转基因产品审核周期的缩短和新品种的早期释放,对提高转基因植物安全性和加快其商品化进程具有重要意义。还构建了用于基因叠加的目标载体、整合载体和重组载体,探索利用位点特异性重组系统进行基因的定向叠加,对研究外源基因精确的整合、表达奠定了一定的基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 目录
  • 1 引言
  • 1.1 LFY基因的研究进展
  • 1.1.1 植物成花机理的研究
  • 1.1.1.1 花序分生组织特征基因
  • 1.1.1.2 花分生组织特征基因
  • 1.1.1.3 花器官特征基因
  • 1.1.2 LFY基因的作用
  • 1.1.3 LFY基因的表达调控
  • 1.2 转基因植物的安全性问题
  • 1.2.1 转基因植物的环境安全性问题
  • 1.2.2 转基因植物的食品安全性问题
  • 1.3 解决转基因安全性问题的策略
  • 1.3.1 去除选择标记基因
  • 1.3.1.1 利用共转化系统
  • 1.3.1.2 利用位点特异性重组系统
  • 1.3.1.3 利用转座子成分去除标记基因
  • 1.3.1.4 利用多元自主转化载体系统
  • 1.3.1.5 利用同源序列重组系统
  • 1.3.2 选用安全的标记基因
  • 1.3.2.1 糖类代谢酶标记基因利用
  • 1.3.2.2 激素代谢酶标记基因利用
  • 1.3.2.3 化合物解毒酶标记基因
  • 1.3.2.4 报告基因
  • 1.4 菊花基因工程研究进展
  • 1.4.1 转基因菊花育种研究进展
  • 1.4.1.1 报告基因的转入
  • 1.4.1.2 花色素调节基因的转入
  • 1.4.1.3 改变株型基因的转入
  • 1.4.1.4 抗性基因的转入
  • 1.4.1.5 调节花期基因的转入
  • 1.4.2 菊花基因工程中存在的问题
  • 1.5 本研究的设计思想
  • 1.5.1 本研究的目的和意义
  • 1.5.2 研究设计和研究内容
  • 1.5.3 本研究的独创性与新颖之处
  • 1.5.4 主要技术路线
  • 2 双T-DNA植物表达载体的构建
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.1.1 菌种与质粒
  • 2.1.1.2 试剂
  • 2.1.1.3 主要仪器和设备
  • 2.1.2 方法
  • 2.1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
  • 2.1.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
  • 2.1.2.3 DNA片段的酶切和回收
  • 2.1.2.4 双T-DNA载体的构建
  • 2.1.2.5 农杆菌感受态细胞的制备和液氮冻融法转化农杆菌
  • 2.1.2.6 根癌农杆菌Ti质粒的提取
  • 2.1.2.7 农杆菌中阳性克隆的筛选和鉴定
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 LFY基因目的片段的获得
  • 2.2.2 中间载体pCAMBIA1300-LFY的重组及鉴定
  • 2.2.3 无多克隆位点的载体pCAMBIA1300-的鉴定
  • 2.2.4 重组质粒pCAMBIA1300-LFY-hpt的鉴定
  • 2.2.5 植物表达载体向农杆菌转化和转化子的鉴定
  • 2.3 讨论
  • 3 菊花转基因受体系统的建立
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 植物材料和菌株
  • 3.1.2 主要试剂仪器以及培养基成分
  • 3.1.3 菊花不定芽再生体系的建立
  • 3.1.4 菊花对抗生素的敏感性试验
  • 3.1.5 遗传转化过程中各种条件的优化
  • 3.1.5.1 预培养时间的确定
  • 3.1.5.2 农杆菌侵染浓度和时间的确定
  • 3.1.5.3 共培养时间和温度的确定
  • 3.1.5.4 生根培养
  • 3.1.6 农杆菌介导的菊花叶盘法转化
  • 3.1.6.1 根癌农杆菌的活化与及工程菌液的制备
  • 3.1.6.2 农杆菌介导的遗传转化流程
  • 3.1.7 数据统计与分析
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 不同激素组合对叶片不定芽再生的影响
  • 3.2.2 菊花对抗生素的敏感性试验
  • 3.2.2.1 潮霉素对菊花叶片外植体再生的影响
  • 3.2.2.2 潮霉素对菊花无菌苗生根的影响
  • 3.2.2.3 抑菌抗生素对‘七月桃花'叶片不定芽诱导和组培苗生根的影响
  • 3.2.3 遗传转化过程中各种条件的优化
  • 3.2.3.1 预培养对菊花遗传转化的影响
  • 3.2.3.2 菌液浓度和侵染时间对菊花转化效果的影响
  • 3.2.3.3 共培养时间和温度对菊花遗传转化的影响
  • 3.2.3.4 最佳遗传转化体系的建立
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 抗生素种类和浓度的选择
  • 3.3.2 菊花遗传转化效率及遗传稳定性
  • 4 无选择标记转基因菊花的筛选
  • 4.1 材料
  • 4.2 主要试剂及仪器
  • 4.3 方法
  • 4.3.1 潮霉素抗性发芽试验
  • 4.3.2 基因组DNA的提取和PCR检测
  • 4.3.3 双探针Southern杂交检测
  • 4.3.3.1 试剂的配制
  • 4.3.3.2 探针的制备
  • 4.3.3.3 标记探针的检测
  • 4.3.3.4 基因组DNA的酶切和电泳
  • 4.3.3.5 DNA的转膜和固定
  • 4.3.3.6 杂交
  • 4.3.3.7 洗膜
  • 4.3.3.8 检测
  • 4.3.4 转基因植株后代的性状分析
  • 4.4 结果与分析
  • 0代植株目的基因与标记基因共转化频率检测'>4.4.1 T0代植株目的基因与标记基因共转化频率检测
  • 0代Southern blot分析'>4.4.2 共转化植株T0代Southern blot分析
  • 1代目的基因与标记基因分离检测'>4.4.3 转基因植株T1代目的基因与标记基因分离检测
  • 2代纯合的无标记含有LFY基因的株系的筛选'>4.4.4 T2代纯合的无标记含有LFY基因的株系的筛选
  • 2代含有LFY基因的纯合株系的性状分析'>4.4.5 T2代含有LFY基因的纯合株系的性状分析
  • 4.5 讨论
  • 4.5.1 转基因菊花叶片的再生能力和对转化植株的鉴定
  • 4.5.2 转基因植物安全性研究
  • 4.5.3 无选择标记转基因植株的获得
  • 4.5.4 共转化系统去除选择标记基因的缺憾与改进策略
  • 4.5.5 共转化法与其他去除选择标记方法的比较
  • 5 利用位点特异性重组系统进行多个基因定向叠加
  • 5.1 特定位点基因叠加的原理
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 材料
  • 5.2.2 方法
  • 5.2.3 重组酶载体pMM-Caggs和pMM-Kozak的构建
  • 5.2.4 整合载体pARTOS2的构建
  • 5.2.5 烟草的遗传转化
  • 5.2.5.1 烟草无菌苗的获得
  • 5.2.5.2 农杆菌介导的遗传转化
  • 5.2.5.3 转基因烟草的PCR检测和gus检测
  • 5.2.5.4 转基因烟草的Southern杂交
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 重组酶载体的获得
  • 5.3.2 整合载体的获得
  • 5.3.2.1 pAB100的获得
  • 5.3.2.2 pAB200的获得
  • 5.3.3 含有目标载体单拷贝烟草的获得
  • 5.4 讨论
  • 6 结论
  • 6.1 研究结论
  • 6.2 存在的问题及展望
  • 参考文献
  • 附表
  • 附录 常用缓冲液及培养基配方
  • 个人简介
  • 获得成果
  • 导师简介
  • 致谢

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