小鼠精原干细胞体外培养体系的初步研究

论文摘要

目的与意义建立并完善小鼠精原干细胞体外扩增的培养体系,并探寻LIF在本体系中对小鼠精原干细胞体外增殖的影响。该体系的建立不仅可以为研究精子发生过程以及干细胞的自我增殖提供新的技术平台,而且将大大促进细胞替代治疗、转基因技术、生殖细胞体外基因操作等技术的发展。材料与方法第一部分:取出生后2～6天的ICR雄性小鼠,脱颈法处死,无菌切取睾丸后,采用两步酶消法制备单细胞悬液,添加含GDNF、LIF、EGF、bFGF等生长因子的特定培养基,以小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层细胞进行体外培养。培养后通过BrdU整合实验分别检测传代至第2代、第5代及第11代精原干细胞的增殖能力并进行比较,采用碱性磷酸酶（AP）染色、免疫荧光及RT-PCR技术对传至第11代的精原干细胞进行鉴定。第二部分:为进一步探索LIF在本培养体系中的作用,我们采用不同细胞因子组合分组对小鼠精原干细胞进行体外培养,在其他实验条件相同的前提下,实验组Ⅰ采用GDNF+bFGF+EGF+LIF的组合,而组Ⅱ仅为GDNF+bFGF+EGF,观察两种培养体系对小鼠精原干细胞体外增殖的影响。在细胞稳定传至第2代、第5代时,通过计数培养孔内生殖细胞克隆数目、BrdU整合实验和TUNEL检测实验比较两组精原干细胞的体外增殖能力和凋亡率。第三部分:取9～12周龄ICR雄性小鼠无菌切取睾丸,两步酶消化后经Ficoll富集,沿用新生小鼠体外培养体系,培养后通过BrdU整合实验检测第5天、第10天、第15天的增殖情况,并采用AP染色及免疫荧光进行鉴定。结果小鼠精原干细胞在体外可稳定增殖,已传至第15代,培养所得克隆AP检测阳性,标记物检测GFRα-1+/Oct-4+/VASA+/SCP3-,基因表达GFRα-1+/Oct-4+/SCP3-,证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。在其他培养条件相同的前提下,培养第2代时添加LIF的组Ⅰ生殖细胞克隆数目平均每培养孔为70.40±8.06,而组Ⅱ为平均每孔37.60±7.15;培养第5代时组Ⅰ克隆数目平均每培养孔为75.20±7.83,而组Ⅱ为平均每孔44.60±6.35,组间均存在统计学差异（P＜0.05）。培养第2代时第3天、第5天两个时间段组ⅠBrdU阳性率分别为46.07±7.95%、45.09±7.80%,组Ⅱ为31.47±3.34%,31.73±3.28%;培养第5代时两个时间段组ⅠBrdU阳性率分别为66.22±7.51%、62.40±6.38%,组Ⅱ为49.68±7.32%,46.30±6.15%。经统计学分析,相同时间段内组ⅠBrdU阳性细胞率均显著高于组Ⅱ（P＜0.05）。培养第2代时第3天、第5天组Ⅰ凋亡率分别为10.67±2.28%、11.06±2.83%;组Ⅱ细胞凋亡率为10.39±1.92%、11.11±2.37%;培养第5代时第3天、第5天组Ⅰ凋亡率分别为11.43±1.80%、11.96±2.56%;组Ⅱ细胞凋亡率为12.12±1.90%、12.30±2.46%。经统计学分析,第3天、第5天两个时间段各实验组阳性细胞百分率均无统计学差异。由以上结果可知,LIF可促进小鼠精原干细胞在体外增殖,但无抗凋亡作用。值得注意的是,在不添加LIF的情况下,新生小鼠精原干细胞也能在体外稳定增殖,提示LIF不是新生小鼠精原干细胞培养体系中必需的细胞因子。与新生小鼠相比,成年鼠精原干细胞细胞生长缓慢,需10～15天才能形成生殖细胞克隆,经BrdU整合实验检测培养第5天、第10天、第15天阳性率分别为14.57±2.01%、26.17±3.36%、16.73±2.46%,提示培养细胞处于增殖状态。培养所得生殖细胞克隆经免疫荧光鉴定AP、GFRα-1、VASA均为阳性,而SCP3仅表现为部分单细胞阳性。但传代后细胞逐渐凋亡。结论1.本研究建立了新生鼠精原干细胞无血清体外培养体系,经15次以上稳定传代,保持未分化状态,为体外探索精子发生过程和干细胞研究提供了良好的技术平台。2.在小鼠精原干细胞培养体系中LIF并不是必需的,但能够促进小鼠精原干细胞的体外增殖。3.成年鼠精原干细胞可在体外短期扩增。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 专业名词缩写中英文对照表
• 实验技术路线图
• 前言
• 第一章 新生小鼠精原干细胞体外培养体系的建立
• 1.1 材料与方法
• 1.2 实验结果
• 1.3 讨论
• 第二章 LIF对小鼠精原干细胞体外增殖的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 第三章 成年小鼠精原干细胞体外培养体系的初步研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果