绿色木霉LTR-2 42kDa几丁质酶基因的克隆及转基因番茄的构建

论文摘要

番茄作为一种主要的经济作物和遗传学上的模式生物,具有重要的研究价值,在植物基因工程研究上被广泛利用。通过插入外源抗性基因,构建转基因抗病番茄,是降低农药使用量和培育新优良作物品种的有效途径。几丁质酶（Chitinase）是一类细胞壁降解酶,普遍存在于各种动物、植物和微生物中。利用几丁质酶编码基因构建的转基因植物能有效地抵抗多种病原菌。然而不同来源的几丁质酶抗病效果差异很大,因此发现一种合适的几丁质酶编码基因对于构建转基因抗病植物具有重要意义。木霉作为一种重要的生防真菌,在其重寄生过程中产生的几丁质酶能够降解多种病原微生物细胞壁。研究证实,在木霉产生的多种几丁质酶中,42kDa几丁质酶被认为是降解病原菌细胞壁效果最好的一种。因此将木霉中的42kDa几丁质酶编码基因整合到植物染色体中,获得抗性植株是目前构建转基因植物研究的重要内容之一。绿色木霉LTR-2（Trichoderma virede）由本实验室从蔬菜植物根系土壤中筛选获得,其制剂已经获得国家发明专利授权,并已经在农业部登记注册为新农药,对多种病原菌具有较好的拮抗作用,其作用机制之一就是产生多种细胞壁降解酶,尤其是42kDa几丁质酶。根据GenBank上已有的42kDa几丁质酶编码基因序列设计适宜的引物,通过PCR技术,从绿色木霉LTR-2基因组DNA中扩增到一段序列,测序结果表明,该编码基因片段大小为1508bp,其中包括一个1459bp的开放阅读框,起始密码子位于45bp,终止密码子位于1501bp,共编码氨基酸424个。通过GenBank进行序列比对,发现该序列同已发表的其他Trichoderma Viride 42kDa几丁质酶氨基酸序列具有99%的同源性,因此确定该序列为42kDa几丁质酶编码基因,该序列已在GenBank上登记（GenbankID:EF635427）。将42kDa几丁质酶基因同质粒pCAMBIA1300中的CaMV35S启动子和35S-polyA终止子连接后,插入植物表达载体pCAMBIA1302多克隆位点中,构建成植物表达载体pCHI1302-42,利用冻融法将载体pCHI1302-42导入根癌农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的叶盘转化法将42kDa基因导入番茄,组织培养后获得了番茄的再生植株。最后采用PCR及Southern杂交对再生转化番茄进行检测,证明42kDa几丁质酶基因已经插入番茄的染色体基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 几丁质酶研究进展
• 1.1.1 几丁质酶概述
• 1.1.2 木霉几丁质酶研究进展
• 1.2 植物转化方法
• 1.2.1 农杆菌转化法
• 1.3 转基因番茄研究进展
• 1.3.1 转基因抗病番茄的研究
• 1.3.1.1 转基因番茄抗真菌病研究
• 1.3.1.2 转基因番茄抗病毒病研究
• 1.3.2 番茄抗虫基因工程
• 1.3.3 番茄抗除草剂工程
• 1.3.4 番茄抗逆基因工程
• 1.4 内含子与植物基因工程
• 1.5 转基因植物基因沉默及预防策略
• 1.6 番茄基因工程展望
• 1.7 本研究的目的和意义
• 技术路线
• 第二章 几丁质酶基因的克隆及植物表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.1.4 菌种保藏技术
• 2.1.5 几丁质酶基因的克隆
• 2.1.5.1 绿色木霉LTR-2基因组DNA的提取
• 2.1.5.2 PCR引物设计与PCR扩增反应
• 2.1.5.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.5.4 PCR样品的纯化
• 2.1.5.5 连接反应
• 2法转化大肠杆菌'>2.1.5.6 CaCl₂法转化大肠杆菌
• 2.1.5.7 重组质粒的筛选
• 2.1.5.8 转化质粒的提取
• 2.1.5.9 限制性内切酶酶切
• 2.1.5.10 目的基因的全序列测定
• 2.1.5.11 基因序列分析
• 2.1.6 植物表达载体pCHI1302-42的构建
• 2.1.6.1 42kDa几丁质酶基因与pCAMBIA1300的连接
• 2.1.6.2 正向连接重组质粒的筛选
• 2.1.6.3 42kDa几丁质酶基因片段的获得
• 2.1.6.4 42kDa几丁质酶基因与植物表达载体的连接
• 2.1.7 农杆菌的冻融法转化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 绿色木霉LTR-2 42kDa几丁质酶基因的克隆
• 2.2.2 重组质粒pMChi42限制性内切酶酶切分析
• 2.2.3 重组质粒pMChi42所携带的外源片段的核苷酸全序列测定
• 2.2.4 42kDa几丁质酶基因及其所编码蛋白的性质分析
• 2.2.5 pCHI1302-42的构建方案
• 2.2.5.1 正向连接重组质粒的筛选
• 2.2.5.2 42kDa几丁质酶基因与植物表达载体的连接
• 2.2.6 根癌农杆菌LBA4404转化菌株筛选
• 2.3 讨论
• 第三章 利用42kDa几丁质酶编码基因转化番茄
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要药品及试剂
• 3.1.3 根癌农杆菌培养基
• 3.1.4 植物组织培养培养基配制
• 3.1.4.1 共培养培养基
• 3.1.4.2 筛选分化培养基
• 3.1.4.3 生根培养基
• 3.1.5 实验方法
• 3.1.5.1 番茄无菌苗的培养
• 3.1.5.2 外植体的获得及处理
• 3.1.5.3 外植体的转化
• 3.1.5.4 筛选及分化培养
• 3.1.5.5 生根培养
• 3.1.6 再生植株的分子检测
• 3.1.6.1 CTAB法小量提取植物基因组DNA
• 3.1.6.2 聚合酶链式反应（PCR）检测
• 3.1.6.3 Southern blotting分析
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 激素对愈伤组织诱导的影响
• 3.2.2 转基因植株的获得
• 3.2.3 植物基因组DNA
• 3.2.4 再生植株PCR检测
• 3.2.5 再生植株Southern blotting检测
• 3.3 讨论
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢