西瓜、甜瓜遗传转化体系的建立及转基因植株的抗病性分析

论文摘要

植物真菌病害一直是影响农作物产量,降低农作物品质的主要原因,西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Mantsum.et Nakai]和甜瓜（Cucumis melon Linn.）是经济价值很高的水果,其栽培面积和产量我国在世界上均占首位,但其病害种类繁多,尤其以真菌性病害最为严重,是瓜类生产中存在的主要问题。在植物抗病基因工程中,通过将抗真菌蛋白基因转入植物来提高农作物对真菌病害的抵抗能力已成为一种直接有效的方法,虽然植物抗病基因工程在一些重要农作物改良中取得了一定进展,但是由于瓜类遗传基础狭窄、抗病种质资源缺乏、抗病遗传规律的复杂性和西瓜、甜瓜存在组培再生困难、试管苗移栽成活率低和遗传转化体系较难优化等问题,使基因工程在瓜类作物的抗病遗传育种应用受到限制,因而这方面的应用研究起步较慢。我们系统研究了西瓜、甜瓜组织培养体系,优化了农杆菌介导的西瓜、甜瓜遗传转化体系.构建了含有烟草的几丁质酶基因（CHI ）和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因（GLU ）和小麦的硫堇蛋白基因（THI）的三价抗真菌融合基因植物表达载体转化西瓜、甜瓜,成功地获得了9株转基因甜瓜和7株转基因甜瓜株系,并进行了相关分子生物学鉴定,期望从中筛选出抗病性增强的品种来为常规育种提供材料,以求在生产上达到提高瓜类对真菌病害的抵抗能力。主要实验结果如下:1建立了高效西瓜、甜瓜组织培养体系①茎尖与子叶切块可诱导分化不定芽,愈伤组织也可诱导不定芽分化,但频率很低,真叶、下胚轴和茎段仅能诱导出愈伤组织。②建立了以西瓜、甜瓜子叶块为外植体的不定芽分化再生体系,其最适培养基分别为MS+6-BA1.0 mg/L +IBA0.5 mg/L和MS+6-BA2.0 mg/L +IBA0.5 mg/L,在最适培养基上二者的不定芽诱导率分别可达91.2%和94.3%.③一定浓度的6-BA是诱导瓜类子叶块外植体分化的关键,基因型不同的诱导率不同,但对于瓜类不同品种而言,附加低浓度的IBA则有利于这种分化的发生,无激素培养基上的外植体则不能诱导出不定芽。④无菌苗子叶颜色由黄色转呈浅绿色时的子叶块最适合于不定芽的诱导,诱导率最高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 葫芦科概述
• 1.1.1 葫芦科的特征
• 1.1.2 葫芦科种类
• 1.1.3 西瓜概述
• 1.1.4 甜瓜概述
• 1.2 植物组织培养技术研究进展
• 1.2.1 愈伤组织分类
• 1.2.2 愈伤组织再生植株途径
• 1.2.3 外植体类型
• 1.2.4 培养条件
• 1.3 西、甜瓜组织培养愈伤组织再生植株研究进展
• 1.3.1 西瓜、甜瓜组培再生体系的建立
• 1.3.2 西瓜、甜瓜转基因方法
• 1.3.3 转基因对西瓜、甜瓜有益农艺性状的改良及其展望
• 1.4 抗真菌植物基因工程的策略和进展
• 1.4.1 植物病程相关蛋白（PR）和水解酶
• 1.4.2 抗真菌蛋白（或肽）
• 1.4.3 核糖体灭活蛋白（RIP），PR 蛋白
• 1.4.4 溶菌酶
• 1.4.5 抗菌肽
• 1.4.6 利用渗透蛋白基因
• 1.4.7 我国自己发现的抗真菌蛋白
• 1.4.8 导入作物自身的真菌抗性基因
• 1.4.9 调节植物防卫反应的基因激发子
• 1.4.10 利用植物抗病基因
• 1.4.11 抗真菌基因工程面临的挑战
• 1.4.12 抗真菌基因工程中存在的问题、解决途径及展望
• 1.5 西瓜、甜瓜抗真菌病害育种研究进展
• 1.5.1 西瓜枯萎病简介
• 1.5.2 枯萎病的防治及抗病育种研究进展
• 1.5.3 西瓜、甜瓜抗病育种中面临的问题
• 1.5.4 西瓜、甜瓜抗病基因工程进展
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 生化试剂和其它材料来源
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 西瓜、甜瓜组培再生体系的建立
• 2.2.2 西瓜、甜瓜的遗传转化
• 2.2.3 以 PNZIP 为启动子的质粒的改造
• 2.2.4 连接产物的转化及阳性克隆筛选
• 2.2.5 以PNZIP 为启动子的质粒转入农杆菌LBA4404 和农杆菌EHA105
• 2.2.6 利用农杆菌介导转化西瓜、甜瓜
• 2.2.7 西瓜、甜瓜转化植株的 PCR 检测
• 2.2.8 转基因植株的 Northern blot 检测
• 2.2.9 转基因西瓜、甜瓜植株内葡聚糖和几丁质酶活性的测定
• 2.2.10 转基因西瓜、甜瓜的抗病检测
• 3. 结果与分析
• 3.1 西瓜、甜瓜离体再生体系的建立
• 3.1.1 种胚发芽率
• 3.1.2 不定芽的诱导
• 3.2 农杆菌介导西瓜、甜瓜遗传转化体系的优化
• 3.2.1 抗生素敏感性
• 3.2.2 预培养对遗传转化的影响
• 3.2.3 农杆菌菌株类型和共培养时间对转化的影响
• 3.2.4 菌液浓度对转化频率的影响
• 3.2.5 侵染时间对转化频率的影响
• 3.2.6 乙酰丁香酮（acetosyringone;AS）等对农杆菌介导转化的影响
• 3.3 植物表达载体的构建
• 3.3.1 三价融合基因（FG）的来源、特征和空间结构
• 3.3.2 PNZIP 启动子
• 3.3.3 构建以 PNZIP 为启动子的三价融合基因的过程
• 3.3.4 融合基因的 PCR 鉴定
• 3.3.5 融合基因转入农杆菌
• 3.4 转基因西瓜、甜瓜植株的获得
• 3.4.1 抗kan 西瓜、甜瓜植株 PCR 检测
• 3.4.2 转 FG1 基因中的西瓜、甜瓜植株葡聚糖酶（GLU）PCR 检测
• 3.4.3 转 FG1 基因中的西瓜、甜瓜植株几丁质酶（CH1）PCR 检测
• 3.4.4 转 FG1 基因中的西瓜、甜瓜植株硫堇蛋白（TH1）PCR 检测
• 3.4.5 转 FG1 基因西瓜、甜瓜植株 PCR 检测
• 3.4.6 转基因西瓜、甜瓜 Northern blot 分析
• 3.5 转基因西瓜、甜瓜的抗病性分析
• 3.5.1 转基因西瓜、甜瓜抗灰霉菌试验
• 3.5.2 转基因西瓜、甜瓜抗炭疽菌抗性试验
• 3.5.3 转基因西瓜对枯萎病抗性试验
• 3.5.4 转基因西瓜、甜瓜植株的葡聚糖酶和几丁质酶活性测定
• 4. 讨论
• 4.1 西瓜、甜瓜离体再生体系的建立
• 4.2 农杆菌介导西瓜、甜瓜遗传转化体系的优化
• 4.3 植物抗病基因工程中多个基因联合导入
• 4.4 植物抗病反应中抗真菌蛋白的协同效应
• 4.5 植物抗病反应中抗病基因的高效定位表达
• 彩图1
• 彩图2
• 彩图3
• 彩图4
• 彩图5
• 结论
• 参考文献
• 致谢