α-生育酚对链脲菌素诱导离体大鼠胰岛β细胞损伤的干预研究

论文摘要

第一部分:分离、培养的新生大鼠胰岛β细胞形态及功能鉴定目的:探讨体外培养的新生大鼠胰岛β细胞的功能状态。方法:采用胶原酶对1～3日龄Wistar大鼠胰腺组织进行分次短时消化。倒置显微镜观察接种18h细胞生长情况。继续培养72h,双硫腙（dithizone,DTZ）染色及胰岛素免疫组化染色鉴定β细胞,放射免疫法检测葡萄糖刺激下胰岛素分泌水平。结果:台盼蓝染色胰岛细胞存活率>90%,DTZ染色可染率>80%,细胞分泌功能正常。结论:胶原酶分次短时消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的分离培养方法为本实验提供了纯度较高、功能良好的胰岛细胞。第二部分:α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预效应目的:探讨α-生育酚（α-tocopherol,α-T）对链脲菌素（strep- tozotocin,STZ）诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预效应。方法:1.分组:分离1～3日龄Wistar大鼠胰腺进行体外培养,培养的细胞随机分为4组:（1）对照组:培养的胰岛细胞不作任何干预处理;（2）α-T组:培养液中仅加入终浓度为20mg/Lα-T作用24h;（3）STZ组:培养液中仅加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min;（4）干预组:培养液中加入终浓度为20mg/Lα-T预处理24h后,再加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min。各组作用时间一到,即离心弃上清液,用新鲜培养液重悬细胞,继续培养18h后检测各项指标。2.方法:采用MTT比色法检测胰岛细胞活性,放射免疫法检测上清液中胰岛素含量,透射电镜观察细胞形态,Hochest33258荧光染色观察细胞荧光强度,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:与对照组比较,STZ组胰岛细胞活性、胰岛素含量明显降低,而胰岛细胞凋亡率显著升高（p<0.05）。同时,STZ组电镜观察到凋亡细胞,Hochest33258荧光染色发现发明亮淡蓝色强荧光细胞数显著增多（p<0.05）。而在STZ作用前给予α-T预处理的干预组,胰岛细胞活性、胰岛素含量及胰岛细胞凋亡率虽未恢复到对照组水平,但其下降和上升的程度较STZ组出现明显抑制（p<0.05）。结论:α-T能够抑制STZ所致胰岛β细胞凋亡而起到β细胞保护作用。第三部分:α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预机理目的:探讨α-T对STZ诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预机理。方法:1.分组:同第二部分。2.方法:采用分光光度计测量上清液中总抗氧化能力（T-AOC）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平,一氧化氮合酶（NOS）活性、NO水平及胰岛细胞特异性半胱氨酸酶-3（caspase-3）活性、特异性半胱氨酸酶-8（caspase-8）活性。免疫组化法测定胰岛细胞bcl-xl、bax蛋白表达。结果:与对照组比较,STZ组上清液中T-AOC水平、SOD活性明显降低（p<0.05）,MDA、NO水平显著升高（p<0.05）,而NOS活性无显著性改变（p>0.05）。胰岛细胞caspase-3活性、caspase-8活性、bax表达明显升高（p<0.05）,bcl-xl表达明显降低（p<0.05）。在STZ作用前给予α-T预处理的干预组,上述指标的变化虽未恢复到对照组水平,但其下降和上升的程度较STZ组出现明显抑制（p<0.05）。结论:α-T抑制STZ所致胰岛β细胞凋亡的机制与增强细胞抗氧化能力,清除自由基,减少脂质过氧化,从而降低caspase-3、caspase-8、bax/bcl-xl比例有关。第四部分:α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤干预的剂-效关系目的:探讨α-T对STZ所致大鼠胰岛β细胞损伤干预的剂-效关系。方法:培养的胰岛细胞分为4组:（1）对照组:培养的胰岛细胞不作任何干预处理;（2）α-T组:培养液中仅加入终浓度为80mg/Lα-T作用24h;（3）STZ组:培养液中仅加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min;（4）干预组:培养液中加入终浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L及80mg/L的α-T作用24h后,再加入终浓度为0.58mg/L的STZ作用30min。各组作用时间一到,即离心弃上清液,用新鲜培养液重悬细胞,继续培养18h后采用MTT法检测胰岛细胞活性、放射免疫法测定胰岛素含量、分光光度计测量上清液中T-AOC水平。结果:与STZ组比较,不同浓度α-T（5～80mg/L）干预组中胰岛细胞活性、胰岛素分泌量及T-AOC水平都有明显回升（p﹤0.05）,该效应随α-T浓度的增加而增强,呈一定剂量依赖趋势（不同浓度干预组间比较p﹤0.05）。结论:α-T对胰岛细胞的保护作用呈一定剂量依赖趋势。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 分离、培养的新生大鼠胰岛β细胞形态及功能鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预效应
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤的干预机理
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分 α-生育酚对链脲菌素诱导大鼠胰岛β细胞损伤干预的剂效关系
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录