鸡CD4基因片段的原核表达与单克隆抗体制备

论文摘要

CD4分子是T淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴细胞重要的表面标志。鸡CD4基因定位于1号染色体，基因全长11.5kb，共有10个外显子。鸡CD4基因编码的成熟蛋白包含由四个类免疫球蛋白的胞外区（402个氨基酸），一个疏水跨膜区（24个氨基酸）和一个较长的胞浆区（33个氨基酸）组成。CD4分子主要存在于辅助性T细胞、调节性T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面。CD4分子作为辅助受体参与TCR对MHCⅡ类分子递呈抗原的识别。CD4还是一类信号传递受体，分子胞内部分通过酪氨酸激酶途径参与经TCR介导的信号级联反应，引发一系列的免疫应答。鸡和哺乳动物的CD4分子在结构和功能上的保守性很高，这些保守性与鸡的免疫系统紧密相关。为建立鸡CD4分子的检测方法，进一步研究其基因结构及其生物学作用，本研究进行了鸡CD4分子基因片段的原核表达、单克隆抗体制备和单抗的免疫学活性鉴定。首先，参照GenBank中已经登录的鸡CD4cDNA序列，以及pET-32a载体多克隆位点序列设计了一对引物。利用PCR技术扩增了鸡CD4分子中去除信号肽的N端2个免疫球蛋白样区基因片段。其大小为579bp，与GenBank中登录的鸡CD4（登录号：Y12012）的序列进行比对，结果完全一致。将其插入表达载体pET-32a，获得了重组表达载体pET-32a-CD4。将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），优化表达条件后进行诱导以大量表达目的蛋白。裂解诱导培养的菌体纯化包涵体，包涵体再经过体外溶解、复性后经Ni-NTA纯化介质纯化得到了His-CD4融合蛋白，符合预测结果，大小约为42KD。表达产物经His-NTA树脂亲和层析柱分离纯化，得到了纯度较好的鸡His-CD4融合蛋白。其次，将纯化后的His-CD4融合蛋白免疫8周龄的Balb/c小鼠。经4次免疫，血清抗体达到1：10000以上，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。经多次亚克隆和细胞上清液中抗体检测，获得一株阳性杂交瘤细胞株，命名为3E12。Western-blot实验结果显示，该细胞株上清液的抗体与目的蛋白发生特异性反应。将该细胞株注射Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，腹水抗体的间接ELISA效价为1:105。用试剂盒鉴定的单抗的免疫球蛋白亚类为IgG2b。综上所述，本研究在成功克隆鸡CD4基因片段的基础上，构建了表达重组载体pET-32a-CD4质粒，并表达获得了目的基因的融合蛋白。通过细胞融合制备了稳定分泌特异性针对目的蛋白单抗的细胞株，并对单抗效价和亚类做了鉴定。本研究为鸡CD4生物学作用的进一步研究提供了材料。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 插图和附表清单
• 本文常用缩写词
• 文献综述
• 1 CD4+T细胞的发育与功能
• 1.1 CD4+T细胞的发育及其分布
• 1.2 CD4+CD8+双阳性T细胞
• 1.3 CD4+T细胞亚群及其功能
• 2 CD4分子的结构与功能
• 2.1 分子结构
• 2.2 分子功能
• 3 鸡CD4+T细胞与传染性疾病的关系
• 4 鸡CD4分子单克隆抗体的应用
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 鸡CD4基因片段的原核表达
• 1.3 单抗制备与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 pET-32a-CD4表达质粒的构建与克隆
• 2.2 His-CD4融合蛋白的表达与纯化
• 2.3 单抗制备与鉴定
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介