肝细胞癌中ASPP1、ASPP2基因表达及其启动子区CpG岛甲基化的实验研究

论文摘要

目的:抑癌基因p53促凋亡活性丧失是肿瘤形成的主要因素之一。肝癌中约30～40%存在p53基因突变,而肝癌细胞野生型p53基因的功能丧失则可能与ASPP基因家族调控失常有关。ASPP（apoptosis stimulatingprotein of p53,ASPP）基因家族中ASPP1、ASPP2能选择性增强p53的促细胞凋亡功能。本实验研究肝癌细胞中ASPP1、ASPP2基因的异常表达及启动子区甲基化调控机制,并以临床组织标本佐证,以期探讨原发性肝癌形成中ASPP1、ASPP2表达异常的分子机制,寻求肝癌早期防治分子靶点。方法:1.利用RT-PCR方法检测ASPP1、ASPP2在7种肝癌细胞中表达水平,利用MSP-PCR方法检测ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化状况;以肝癌细胞Huh7为细胞模型,观察甲基转移酶抑制剂（5’-aza-2’CdR）和（或）组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）对ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化与mRNA表达的影响。分析肝细胞中ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化状态与mRNA表达异常的相互关系。2.MSP-PCR法检测52例肝癌及癌旁组织ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化状况,免疫组化法检测其中41例肝癌组织标本p53基因突变蛋白,分析ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化状况。p53突变和临床指标的关系。结果:1.RT-PCR法检测结果显示ASPP1、ASPP2基因mRNA在各个肝癌细胞中都有表达,但表达量各不相同,肝癌细胞Huh7表达量最弱,肝癌细胞HepG2表达量相对较强,但所有肝癌细胞ASPP1、ASPP2基因mRNA表达量均小于肝细胞HL7702。2.MSP-PCR法检测结果显示ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化引物在大部分肝癌细胞中能扩增出阳性条带,但肝癌细胞HepG2和肝细胞HL-7702无阳性条带;非甲基化引物除了肝癌细胞Huh7在其他细胞株中均能扩增出阳性条带。肝癌细胞HepG2和肝细胞HL-7702表现为ASPP1、ASPP2基因启动子非甲基化状态;肝癌细胞Huh7表现为完全甲基化状态;其余肝癌细胞则表现为半甲基化状态。3.甲基转移酶抑制剂（5’-aza-2’CdR）和（或）组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）能逆转ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化并上调mRNA表达,两者呈现剂量依赖关系并有协同作用。4.MSP-PCR检测52例肝癌组织中ASPP1基因启动子区甲基化病例有21.1%（11/52）,ASPP2基因甲基化病例有34.6%（18/52）,两个基因均甲基化病例有5.7%（3/52）,两个基因中有一个存在甲基化病例占50%（26/52）;癌旁组织中ASPP1基因启动子区甲基化病例占15.3%（8/52）,ASPP2基因甲基化病例占23%（12/52）,两个基因均甲基化病例有5.7%（3/52）,两个基因中有一个存在甲基化病例占32.6%（17/52）。免疫组化显示肝癌组织中p53蛋白染色阳性（p53基因突变）为34.1%例（14/41）,癌旁组织p53蛋白染色阴性;临床肝癌组织ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化与p53蛋白染色阳性负相关（p=0.042）;癌旁组织中ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化与肿瘤大小（p=0.022）,临床分期（p=0.046）负相关。结论:1.肝癌细胞ASPP1、ASPP2基因启动子区高度甲基化状态导致mRNA表达下调。2.肝癌及癌旁组织ASPP1、ASPP2基因启动子区甲基化状态与p53蛋白染色阳性,肿瘤大小,临床分期负相关,提示了ASPP1、ASPP2表达异常可能参与肝癌形成。

论文目录

• 一、英文缩写词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、前言
• 五、论文正文
• 第一部分 肝癌细胞中ASPP1、ASPP2基因表达及其启动子区甲基化调控机制的研究
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 第二部分 临床肝癌组织ASPP1、ASPP2基因启动子甲基化与p53基因突变、临床指标关系的研究
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 六、综述一 DNA甲基化与肿瘤治疗策略研究进展
• 七、综述二 ASPP基因家族在肿瘤研究中的进展
• 八、攻读学位期间发表的文章
• 九、致谢
• 附Clinic Cancer Research收录文章全文