蔗糖转运蛋白基因在提高甜菜含糖量中的初步研究

论文摘要

蔗糖是植物光合作用同化产物最主要的转运形式,其转运的方向和速率对于高等植物的生长发育至关重要。蔗糖由源向库的运输是通过韧皮部进行的。蔗糖转运蛋白（sucrose/H+ cotransporters或sucrose transporters, SUCs或SUTs）在蔗糖转运过程中起着极为重要的作用。在农业生产中,为了获得高产,不仅要设法提高光合作用形成的生物学产量,而且要通过一定的措施来提高经济学的产量。利用蔗糖转运蛋白来定向的提高经济学的产量,是一种调控库源关系的有效手段。因此,分离、鉴定高等植物蔗糖转运蛋白,并对其功能进行深入研究不仅具有深远的理论意义,而且对提高农作物的经济产量具有重大的实践价值。甜菜是2年生异交草本植物,由于其栽培驯化时间较短,遗传背景狭窄,资源贫乏。特别是自交高度不亲和性,往往使得优良单株基因型很容易丢失,给优良品种选育材料的繁殖和保存带来了不少的困难。因此可以通过植物组织培养为甜菜基因工程育种提供新的途径。目前关于甜菜组织培养的众多研究表明,采取直接器官发生再生植株方式（不经历愈伤组织阶段）获得的再生苗更适合作为转化外源基因的受体植物。本实验根据蔗糖转运蛋白在糖分积累中的作用,从调控源到库的关系的角度出发,利用分子生物学手段,从拟南芥中分别克隆AtSuc3和AtSuc4基因,从葡萄中分别克隆VvSuc11和VvSuc12基因,并利用甘薯贮藏蛋白基因（sporamin）的根部特异性启动子分别构建相应的单价和双价的植物表达载体:pBI2301-Q3- S3、pBI2301-Q3- S12、pBI2301-Q4- S4、pBI2301-Q4- S11和pBI2301-Q3- S3-Q4- S4。甜菜是比较难以再生的植物。本研究通过筛选,成功建立了甜菜（kws9103）叶柄直接再生体系,实验通过种植无菌苗、预培养、诱导分化培养,获得了再生植株,建立了甜菜快速繁殖体系。结果表明:甜菜种子经过消毒处理,其幼苗经MS附加一定量的6-BA和NAA组合的培养基中预培养,再取叶柄作为外植体转入预培养的培养基中诱导不定芽,不定芽诱导率为50%。MS附加一定量的IBA生根培养基,诱导生根率在75℅以上,移栽成活率高达95%.种子萌发培养基:（1）1/2 MS。预培养培养基:（2）MS+6-BA0.5mg·L-1（单位下同）+NAA0.05。不定芽诱导培养基:（3）MS+6-BA0.5+NAA0.05。生根培养基:（4）MS+IBA2.0。将构建好的植物表达载体侵染甜菜进行了初步的遗传转化试验,为进一步研究蔗糖转运蛋白基因在转基因甜菜中调控蔗糖转运功能打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 英文缩写词表
• 前言
• 文献综述
• ㈠ 甜菜业发展
• ㈡ 甜菜转基因研究进展
• ㈢ 蔗糖转运蛋白研究进展
• ㈣ 结束语
• 第一章 甘薯贮藏蛋白基因（sporamin）根部特异性启动子的分离、蔗糖转运蛋白基因的克隆
• 1 实验材料
• 1.1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶、试剂盒、常用生化试剂
• 1.3 植物材料
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 根部特异性启动子的克隆的获得
• 2.2 拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSuc3 和AtSuc4 的克隆
• 2.3 葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC11 和VvSUC12 的克隆
• 3 根部特异性启动子、蔗糖转运蛋白基因克隆结果与分析
• 3.1 根部特异性启动子的克隆和序列分析
• 3.2 AtSuc3 基因的克隆和序列分析
• 3.3 AtSuc4 基因的克隆和序列分析
• 3.4 VvSUC11 基因的克隆和序列分析
• 3.5 VvSUC12 基因的克隆和序列分析
• 第二章 植物表达载体的构建及农杆菌的转化
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 2 方法
• 2.1 植物表达载体pBI121-Q3-GUS 的构建
• 2.2 植物表达载体pBI2301-Q3-S3、pBI2301-Q3- S12 的构建
• 2.3 植物表达载体pBI2301-Q4- S4、pBI2301-Q4- S11 的构建
• 2.4 植物表达载体pBI2301-Q3-S3-Q4- S4 的构建
• 2.5 植物表达载体转化根癌农杆菌AGL1
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体pBI121-Q3-GUS 的酶切鉴定
• 3.2 植物表达载体pBI2301-Q3- S3、pBI2301-Q3- S12 的酶切鉴定
• 3.3 植物表达载体pBI2301-Q4- S4、pBI2301-Q4- S11 的酶切鉴定
• 3.4 植物表达载体pBI2301-Q3- S3-Q4- S4 的酶切鉴定
• 第三章 甜菜叶柄直接再生体系的建立
• 1 实验材料
• 1.1 供试植物材料
• 1.2 试剂材料
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 培养条件
• 2.2 培养基配制与配方
• 2.3 种子消毒与接种
• 2.4 预培养
• 2.5 不定芽诱导
• 2.6 诱导生根
• 2.7 植株移栽
• 3 结果与分析
• 3.1 基因型筛选
• 3.2 预培养对幼苗生长的影响
• 3.3 外植体不经过愈伤阶段直接诱导出不定芽
• 3.4 生根和移栽
• 第四章 植物的遗传转化及检测
• 1 实验材料
• 1.1 实验材料
• 2 方法
• 2.1 培养基的种类
• 2.2 农杆菌侵染液的制备
• 2.3 叶柄转化甜菜
• 3 结果与分析
• 3.1 卡那霉素浓度对甜菜叶柄分化的影响
• 3.2 甜菜转化
• 第五章 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 2.1 蔗糖转运蛋白的讨论
• 2.2 甜菜叶柄直接再生体系的讨论
• 2.3 本实验的创新点
• 参考文献
• 附录一 主要技术路线
• 附录二 载体构建流程图
• 致谢
• 作者简介
• 附件