论文摘要
背景与目的:支气管哮喘是一种由多种炎性细胞参与的慢性气道变应性炎症性疾病,其机制尚未完全阐明。Th2细胞过度活化,分泌细胞因子IL-4、IL-5和IL-13是哮喘发生发展的关键。近年来研究发现支气管哮喘患者存在调节T细胞（Regulatory T cells, Tregs）功能异常和分化数量减少,因此有人提出Th2/Tregs比例失衡在哮喘发病中起到重要的作用。CD4 + CD25 + FoxP3+ Tregs是Tregs亚群,通过抑制Th1、Th2、CD8 + T、树突状细胞（dendritic cells,DCs）等炎症细胞的功能对哮喘起到保护作用。因此,促使Tregs在体内扩增的策略可能对减轻哮喘变异性气道炎症起到重要的作用。1,25二羟维生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25（OH）2D3]是维生素D的生物活化形式。近期研究发现,1,25（OH）2D3除了参与调节钙和骨的代谢,细胞增殖与分化外,它还具有免疫调节作用。T细胞和DC是1,25（OH）2D3作用的主要靶细胞。1,25（OH）2D3可直接作抑制T细胞活化、增殖和IL-2和IFN-γ分泌,诱导分泌IL-10调节性T细胞（IL-10-Tregs）生成。1,25（OH）2D3对DC的作用主要体现在抑制DC分化和成熟,下调共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达,减少IL-12分泌,增加IL-10的分泌,使DC具有致耐受特性。体内外实验研究均已证实1,25（OH）2D3对Th1介导的自身免疫性疾病和移植排斥均有保护作用。但是,1,25（OH）2D3在Th2介导的变应性哮喘中作用的实验研究结果还存在不一致,多数实验观察到1,25（OH）2D3对变应性哮喘有保护作用,但其机制还有待阐明。近期体内外研究均发现1,25（OH）2D3具有诱导CD4 + CD25 +Tregs生成的作用,但机制尚不清楚。Notch信号最早发现于果蝇体内,它在细胞分化和个体发育中起着重要的作用。近年的研究发现Notch信号对活化的T细胞向Th1,Th2和调节性T细胞分化具有重要的导向作用。据报道Notch3在CD4+CD25+细胞上的表达水平比在CD4+CD25-细胞上高,超表达Notch3胞内段的转基因小鼠Tregs生成增加。超表达Notch配体Jagged1的人APC能促进产IL-10-Tregs生成,增加免疫抑制性CD4+T细胞,介导抗原特异性的免疫耐受。Hassen Kared等研究发现,体内高表达Jagged2的造血祖细胞通过Notch信号途径诱导外周Tregs的扩增。因此,Notch信号通路在Treg细胞的分化中起重要作用。因此,我们假设,1,25（OH）2D3通过上调DC Notch配体表达诱导CD4+ CD25+ FoxP3+Tregs扩增,恢复哮喘外周免疫耐受,从而减轻变应性哮喘气道炎症。方法:第一部分1、GM-CSF体外诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞（Bone Marrow-derived Dendritic Cells,BMDC）。2、用10-6mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3与BMDC共培养72h,设立对照组,对照组加入等量的PBS。收集细胞用流式细胞仪器检测表面分子CD80、CD86和MHCⅡ。3、用半定量RT-PCR检测各浓度1,25（OH）2D3处理的BMDC和空白对照表达Notch配体Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4 mRNA的水平,用Western Blotting方法检测各浓度1,25（OH）2D3处理BMDC表达Jagged1和Jagged2蛋白水平。4、空白对照BMDC,10-6mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3处理的BMDC分别与正常小鼠脾脏CD4+T细胞共培养,各组均加入10ug/ml OVA ,48h后收集细胞,用流式细胞仪器检测CD4+CD25+FoxP3+ Tregs细胞。5、空白对照BMDC和10-8mol/L 1,25（OH）2D3处理BMDC分别与变应性气道炎症模型小鼠CD4+T细胞共培养,各组均加入10ug/ml OVA,48 h后收集细胞,用流式细胞仪器检测CD4+CD25+FoxP3+ Tregs细胞。6、用流式细胞仪检测正常对照和变应性气道炎症模型小鼠脾脏CD4+CD25+ FoxP3+ Tregs细胞。7、10-8mol/L 1,25（OH）2D3处理的BMDC与正常小鼠CD4+T细胞共培养体系中加入20μl Jagged1（Jagged1组）或Jagged2（Jagged2组）多克隆抗体,对照组用等量的PBS代替多克隆抗体。收集细胞用流式细胞仪器检测CD4+CD25+FoxP3+ Tregs细胞。第二部分:1、分别于第0,7,14天经小鼠腹腔注射OVA 10 ug致敏小鼠,将致敏小鼠随机分为两组:1) 1,25（OH）2D3-DC组:该组小鼠经鼻过继转移1,25（OH）2D3处理BMDC;2)PBS-DC组:该组小鼠经鼻过继转移PBS处理的BMDC。每组5只。用OVA连续6天雾化吸入激发。2、最后一次雾化24h后,处死小鼠取肺观察小鼠肺部炎症。3、最后一次雾化24h后,进行支气管肺泡灌洗,计数支气管肺泡灌洗液中EOS数量以及用ELISA方法检测IL4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。4、最后一次雾化结束24h后,取出小鼠脾脏,分离CD4+T细胞,用流式细胞仪检测CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例。结果:第一部分1、体外成功诱导BMDC。2、10-6mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3处理的BMDC表面分子CD80、CD86和MHCⅡ表达均显著下降（P<0.01）,各浓度间无显著差异（P>0.05）。3、10-6mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3处理的BMDC表达Jagged1 mRNA和Jagged2 mRNA显著增加（P<0.01）,各浓度间无显著差异（P>0.05）,Delta4 mRNA无显著变化（P>0.05）,而Delta1和Delta3未见表达。4、10-6mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3处理的BMDC表达Jagged1和Jagged2蛋白显著增加（P<0.01）,各浓度间无显著差异（P>0.05）。5、10-6mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3处理BMDC显著增加正常小鼠CD4+T细胞中CD4+ CD25+FoxP3+Tregs百分比（P<0.01）。6、10-8 mol/L 1,25（OH）2D3处理BMDC显著增加变应性气道炎症模型小鼠CD4+T细胞中CD4+ CD25+FoxP3+Tregs百分比（P<0.01）。7、变应性气道炎症模型小鼠脾脏CD4+T细胞中CD4+CD25+FoxP3+T细胞百分比显著低于正常小鼠（P<0.01）。8、用Jagged1多克隆抗体阻断Jagged1介导的Notch信号途径后,1,25（OH）2D3处理BMDC诱导CD4+CD25+FoxP3+Tregs生成无明显变化（P>0.05）,而用Jagged2多克隆抗体阻断Jagged2介导的Notch信号途径后,1,25（OH）2D3处理DC诱导CD4+ CD25+FoxP3+Tregs生成明显降低（P<0.01）。第二部分1、1,25（OH）2D3处理BMDC过继转移OVA致敏/激发小鼠肺脏炎症性病理改变较对照组症明显减轻,支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量明显减少（P<0.01）。2、1,25（OH）2D3处理BMDC过继转移OVA致敏/激发小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平显著降低（P<0.01）。3、1,25（OH）2D3处理BMDC过继转移致敏/激发小鼠脾脏CD4 + CD25 + FoxP3+Tregs比例显著增加,是未处理BMDC过继小鼠的6倍（P<0.01）。结论:1、1,25（OH）2D3可以抑制DC表面分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达,降低DC成熟程度,成为致耐受型性的DC。后者在体内外均能诱导CD4+CD25+ FoxP3+调节性T细胞的生成,其分子机制与Jagged2介导的Notch信号途径有关。2、1,25（OH）2D3处理DC过继转移OVA致敏小鼠不仅对Th2型反应,而且对Th1型反应也有显著的抑制,同时伴有体内CD4+CD25+ FoxP3+调节性T细胞的增多,提示CD4+CD25+ FoxP3+调节性T细胞是不依赖Th1/Th2平衡的独立调节机制。3、1,25（OH）2D3处理DC能减轻实验小鼠的变应性气道炎症,具有潜在的临床应用价值,为临床治疗哮喘提供了新途径。