单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的克隆及其在酵母中的表达

论文摘要

血栓性疾病一直严重威胁着人类的健康。据相关资料显示,全世界每年有1750万人死于心脑血管病,我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人,每年死于心脑血管疾病的患者多达300万,已成为心脑血管病发病和死亡最严重的国家。应用溶栓剂进行溶栓治疗是当前治疗血栓性疾病的主要手段。目前临床应用的溶栓药物虽然已经发展到第三代,但很多药物存在着特异性差,副作用重,半衰期短及生产不易等缺点。因此,对于溶栓特异性好,半衰期长,生产制备容易的溶栓剂的开发需求迫切。本实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺螠（Urechis unicinctus）中分离出了一组新型纤溶酶,命名为单环刺螠纤溶酶（UFE）,其中包括4个不同分子量的组分,按照分子量由大到小,分别是单环刺螠纤溶酶Ⅰ（分子量45kDa）,单环刺螠纤溶酶Ⅱ（分子量26kDa）,单环刺螠纤溶酶Ⅲ（分子量20kDa）以及单环刺螠纤溶酶Ⅳ（分子量8-10kDa）。4个单环刺螠纤溶酶组分均具有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性,具有较大的开发价值,但以直接从生物体内分离纯化的方法进行生产存在许多弊端,如生产工艺复杂,生产质量不稳定,产率低等。故期望通过本研究克隆得到单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因,并构建出能够产生重组单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因工程菌株。本研究的主要内容如下：1.通过对单环刺螠纤溶酶Ⅱ进行蛋白质N末端测序得到了该酶N-末端氨基酸序列,根据该氨基酸序列设计简并引物,经3’-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的全长cDNA编码序列（共906 bp）,其中开放阅读框长度为795 bp。ufeⅡ全长cDNA序列经BLASTx比对,结果表明该基因编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有一个trypsin domain（第32-264位）,在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。2.成功构建分泌型表达质粒pPICZαA- ufeⅡ-P1/P2,以及pINA 1317-ufeⅡ-Y1/Y2,分别对巴斯德毕赤酵母X-33、SMD1168,及解脂耶氏酵母菌进行了转化,经过对大量阳性转化子的反复筛选没有检测到产生具纤溶酶活性蛋白质的菌株。将透析后的发酵上清液经冷冻干燥进行浓缩,通过SDS-PAGE对样品进行检测未见明显的目的蛋白表达条带,通过免疫印迹的方法同样没有显示有目的蛋白表达。实验结果表明该基因未能在上述三种酵母宿主菌中表达目的蛋白。综上所述,本研究通过分子生物学的一般方法克隆得到了单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的全长cDNA编码序列,通过生物信息学手段对该基因进行了分析,得出该基因编码产物是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,理论分子量为23905.85 Da；成功构建了表达载体,分别对三种酵母宿主菌经行了转化及筛选,为今后对该酶及该基因进一步深入的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 研究背景
• 1.1 血栓性疾病的形成和治疗
• 1.1.1 血栓性疾病及其危害
• 1.1.2 血栓的形成及分类
• 1.1.3 血栓形成机制:凝血系统与纤溶系统
• 1.1.4 血栓性疾病的治疗方法
• 1.2 溶栓药物的研究现状及前景
• 1.3 天然来源溶栓剂及其基因表达研究进展
• 1.3.1 动物来源纤溶酶
• 1.3.2 植物来源纤溶酶
• 1.3.3 微生物来源纤溶酶
• 1.3.4 海洋生物来源的纤溶酶
• 2. 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 2.1 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优势
• 2.2 巴斯德毕赤酵母常用宿主菌
• 2.3 巴斯德毕赤酵母表达载体
• 3 解脂耶氏酵母表达系统研究进展
• 3.1 解脂耶氏酵母表达外源蛋白的优势
• 3.2 解脂耶氏酵母常用宿主菌
• 3.3 解脂耶氏酵母表达载体
• 4. 单环刺螠及其体内活性成分的研究
• 5. 立题依据及研究目的
• 第一章 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料及试剂
• 1.2 培养基
• 1.3 方法
• 1.3.1 蛋白质测序
• 1.3.2 单环刺螠总RNA提取
• 1.3.3 cDNA第一链的合成
• 1.3.4 简并PCR扩增目的片段
• 1.3.5 5’RACE-PCR获得ufe Ⅱ基因5’末端序列
• 1.3.6 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因（ufe Ⅱ）全长扩增
• 1.3.7 生物信息学分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 单环刺螠总RNA提取
• 2.2 简并引物PCR扩增
• 2.3 5’RACE PCR
• 2.4 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因（ufe Ⅱ）全长cDNA扩增
• 2.5 单环刺螠纤溶酶Ⅱ信号肽预测
• 2.6 单环刺螠纤溶酶Ⅱ结构域及活性位点分析
• 2.7 多序列比对及系统进化分析
• 2.8 单环刺螠纤溶酶Ⅱ分子量预测
• 第二章 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶及生化试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 方法
• 1.4.1 表达载体构建
• 1.4.2 巴斯德毕赤酵母X-33感受态的制备及电转化
• 1.4.3 转化巴斯德毕赤酵母X-33阳性克隆检测
• 1.4.4 pPICZaA-ufe Ⅱ-P1,pPICZaA-ufe Ⅱ-P2在巴斯德毕赤酵母X-33中的诱导表达
• 1.4.5 纤溶酶活性检测
• 1.4.6 SDS-PAGE电泳检测
• 1.4.7 免疫印迹（Western blotting）鉴定
• 1.4.8 ufeⅡ基因在巴斯德毕赤酵母SMD1168中的表达
• 2. 结果与讨论
• 2.1 pPICZaA-ufeⅡ-P1,pPICZaA-ufe Ⅱ-P2表达载体的构建
• 2.2 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因在巴斯德毕赤酵母X-33中的表达
• 2.2.1 阳性克隆筛选
• 2.2.2 诱导表达及酶活力测定
• 2.2.3 SDS-PAGE和免疫印迹鉴定
• 2.3 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因在巴斯德毕赤酵母SMD1168中的表达
• 第三章 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因在解脂耶氏酵母中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶及生化试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 方法
• 1.4.1 表达载体构建
• 1.4.2 Y.lipolytica Polh感受态细胞的制备和转化
• 1.4.3 阳性转化子筛选
• 2. 结果与讨论
• 2.1 pINA 1317-ufe Ⅱ-Y1,pINA 1317-ufe Ⅱ-Y2表达载体的构建
• 2.2 单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因Y. lipolytica Po1h中的表达
• 2.2.1 诱导表达及酶活力测定
• 2.2.2 SDS-PAGE和免疫印迹鉴定
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文