五指山猪近交系群体三个白细胞抗原基因序列和功能分析

论文摘要

为确定在五指山猪（WZSP）近交系群体中,白细胞抗原（SLA）基因ⅡDRA、DRB和SLAⅠ3 位点的等位基因数及其序列。本论文利用PCR-SSCP 方法和四对引物按家系对五指山猪（WZSP）近交系群体SLA-ⅡDRA与DRB 和SLAⅠ3 位点分别进行等位基因的检测,及用RT-PCR方法对SLA-ⅡDRB新等位基因cDNA全长序列的克隆与分析。研究结果表明: （1）在五指山猪近交系群体中,SLA-ⅡDRA、DRB 各有两个等位基因且发现一个DRB 新等位基因。DRA 基因有很强的保守性,在对应的cDNA 序列的309 位上发生G/T颠换,可导致一个氨基酸X/M 的改变;而DRB 基因呈现出高度的变异性,在核苷酸水平同源性为85%以上,氨基酸水平同源性为70%以上。（2）SLAⅠ3 位点得到10 个等位基因核苷酸序列,均为新等位基因,这些等位基因间核苷酸变异很少,而与GenBank 其它相应的等位基因则有很大的核苷酸变异。（3）将10 个SLAⅠ3 序列和其它等位基因比对,确定SLAⅠ3 α1 功能区氨基酸变异主要集中在50-85 之间;而另一高变区,即α2 功能区的β-折叠和α-螺旋,则分别集中在氨基酸序列的98-119 和146-172 区域;除HLAⅠ分子β-折叠上与加工处理过外来抗原结合98、100、102、117 和119 五个氨基酸残基外,SLAⅠ类分子α-螺旋上158、159 和170 三个氨基酸残基也位于HLAⅠ分子与外来抗原的结合区域。同时,与HLAⅠ类分子α2 功能区CD8 T 细胞分子识别结合序列比较,发现五指山猪9 个新等位基因编码的氨基酸序列在105、112 和118 等三个关键氨基酸残基与人的完全相同,具有很好的保守性。（4）对SLA-ⅡDRB 新等位基因克隆得到801 个核苷酸残基,除末端终止密码子外,编码266 个氨基酸残基。该序列与美国国立卫生研究所（NIH）小型猪DRB-c、DRB-d等位基因及中国人群高频等位基因HLA-DRB*120101、HLA-DRB*09012 的核苷酸序列及其相应氨基酸序列比对,发现在核苷酸水平上的同源性分别为92%、93%、81%和83%,在氨基酸水平上的同源性为分别为88.7%、91.4%、72.4%和74.8%。同时,与人CD4 T细胞分子识别结合序列比较,发现五指山猪近交系DRB 分子和HLA-DRB 分子与CD4分子结合的关键氨基酸残基序列完全相同。此外,用MEGA3 软件中Tamura-Nei 距离下的邻接（NJ）聚类法（Bootstrap 抽样1000 次）对SLA-DRB 和SLAⅠ3 等位基因核苷酸序列分析,发现五指山猪近交系群体在两个基因位点上都具有其独特的遗传资源,这为五指山猪近交系群体作为实验用动物提供一个更为有利的依据。结论:成功地检测了五指山猪近交系SLA-ⅡDR 和SLAⅠ3 位点的等位基因及其

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 MHC的发现
• 2 猪MHC研究进展
• 2.1 猪MHC（SLA）基因在染色体上的位置
• 2.2 SLA的特点
• 2.3 SLA分类
• 2.3.1 SLAⅠ类抗原分布、组成及基因图谱
• 2.3.2 SLAⅡ类抗原分布、组成及基因图谱
• 2.3.3 SLAⅢ类基因及其研究概况
• 2.4 猪MHC（SLA）的功能概述
• 2.4.1 参与T细胞应答
• 2.4.2 参与免疫应答的遗传控制
• 2.4.3 约束免疫细胞间的相互作用
• 2.4.4 参与抗原处理
• 2.4.5 参与免疫调节
• 2.4.6 参与免疫细胞的分化
• 2.5 SLA的分型与检测
• 2.5.1 免疫学方法
• 2.5.2 分子生物学方法
• 3 SLA的研究展望
• 第二章 实验研究
• 实验一
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物及样品的采集
• 1.1.2 主要的实验仪器和器械
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 猪耳组织基因组DNA提取
• 1.2.2 DNA浓度和纯度的检测
• 1.2.3 PCR引物的设计与合成
• 1.2.4 PCR扩增
• 1.2.5 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳
• 1.2.6 PCR产物的直接测序（DS）
• 1.2.7 序列的拼接和分析
• 1.2.8 同源性序列比较
• 2 结果与分析
• 2.1 五指山猪近交系基因组DNA提取结果
• 2.2 PCR扩增结果
• 2.3 SSCP电泳结果分析
• 2.4 直接测序法（DS）
• 2.5 结果分析
• 3 讨论
• 3.1 关于PCR-SSCP条带的判定
• 3.2 关于PCR产物直接测序
• 3.3 关于五指山猪近交系群体SLA-DRA和DRB外显子2的分析
• 实验二
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 菌株和克隆载体
• 1.1.4 试剂和药品
• 1.1.5 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 提取RNA前的准备工作
• 1.2.2 提取RNA的操作步骤
• 1.2.3 RNA浓度和纯度的检测
• 1.2.4 PCR引物的设计与合成
• 1.2.5 反转录-PCR反应
• 1.2.6 PCR产物的回收
• 1.2.7 PCR产物的克隆
• 1.2.8 重组子的鉴定
• 1.2.9 测序
• 1.2.10 五指山猪SLA-DRBcDNA序列完整阅读框的确定
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的完整性
• 2.2 RT-PCR扩增产物特异性鉴定
• 2.3 PCR扩增产物克隆
• 2.4 菌落PCR扩增检测
• 2.5 质粒酶切鉴定
• 2.6 PCR测序结果
• 2.7 结果分析
• 2.7.1 五指山猪近交系群体DRB新等位基因编码序列的比较分析
• 2.7.2 五指山猪近交系群体DRB新等位基因的进化关系
• 2.7.3 五指山猪近交系群体中新的DRB分子和人CD4结合部位的结构分析
• 3 讨论
• 实验三
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 菌株和克隆载体
• 1.1.4 试剂和药品
• 1.1.5 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 RNA提取和检测
• 1.2.2 PCR引物的设计与合成
• 1.2.3 反转录-PCR反应
• 1.2.4 PCR产物的回收即克隆测序
• 1.2.5 序列的比对和相应氨基酸的推导方法及其分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的完整性检测
• 2.2 RT-PCR扩增产物特异性鉴定
• 2.3 PCR扩增产物克隆
• 2.4 菌落PCR扩增检测
• 2.5 质粒酶切鉴定
• 2.6 PCR测序结果
• 2.7 五指山猪SLAⅠ3等位基因核苷酸序列分析
• 2.8 SLAⅠ3等位基因的氨基酸序列分析
• 2.9 SLAⅠ3等位基因系统树的构建
• 2.10 SLAⅠ类分子与HLAⅠ类分子中NK细胞受体的配体序列比较
• 3 讨论
• 3.1 关于五指山猪SLAⅠ3等位基因的分析
• 3.2 关于五指山猪SLAⅠ3基因的编码氨基酸序列分析
• 3.3 关于与人HLAⅠ类分子中NK细胞受体的配体序列比较分析
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附图