一种苦荞过敏性贮藏蛋白的研究

论文摘要

荞麦具有较高的营养品质和药用价值,并富含多种生物活性物质,在防治现代文明病,诸如糖尿病、高血压等心脑血管疾病和风湿性关节炎等方面具有一定的功效。然而荞麦中含有的过敏性成份又能使许多接触或食用它的人产生过敏症状。近些年来,一些国外的科学家对甜荞（common buckwheat CB）中的过敏成分进行了研究。但在苦荞（tartary buckwheat TB）过敏成分研究方面的报道却不多,有关苦荞过敏蛋白的基因克隆及表达调控的研究尚属空白。 根据先前分离纯化所得天然TBa蛋白经MALDI-TOF-MS（质谱法）测得的氨基酸序列和文献报道的甜荞过敏蛋白核苷酸序列设计引物,利用PCR的方法,并结合3′和5′-RACE方法,得到了编码苦荞过敏性贮藏蛋白（简称TBc）的全长cDNA序列。此序列共长1773bp,5′端有45bp富含GC的序列,在46-1593bp之间有一开放阅读框,共编码515个氨基酸,3′端包括200bp,其中C-端（TBa）包含195个氨基酸,N-端（TBb）包含320个氨基酸。本实验对测得的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列进行了数据分析,包括保守序列分析、二硫键及转录后加工位点预测、信号肽预测、二级结构及3D结构预测、进化树分析、抗原表位预测。 利用盐析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及改进的电洗脱纯化等方法,分别对TBa、TBb、TBc进行了纯化,并将纯化得到的各蛋白进行了免疫活性分析。 根据以上实验结果,推测苦荞过敏性贮藏蛋白TBc由两个亚基构成,分别为TBa（约24kDa）和TBb（约35kDa）,它们通过一个链间二硫键互相连接,其中TBb中还存在一个链内二硫键。ELISA分析表明,TBa和TBb的免疫活性相当,由此推测食用荞麦食品或接触荞麦产品引起的过敏反应可能主要与TBa和TBb有关。 以上内容对深入开展荞麦过敏蛋白结构与功能关系的研究及进一步寻找过敏性贮藏蛋白的抗原表位位点提供了重要的前期工作基础。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.过敏反应及其免疫病理机制
• 2.过敏原
• 2.1 花粉过敏原
• 2.2 食物过敏原
• 3.食物过敏及其诊断、治疗手段的研究进展
• 3.1 食物过敏症
• 3.2 诊断
• 3.3 过敏疾病的防治
• 4.荞麦过敏研究进展
• 4.1 荞麦过敏症
• 4.2 荞麦中导致过敏反应的主要抗原鉴定及性质研究
• 5.展望
• 第二章 苦荞过敏性贮藏蛋白的分离纯化
• 1.材料、仪器、试剂
• 2.方法
• 2.1 苦荞蛋白提取物的制备
• 2.2 蛋白粗品的进一步纯化及性质分析
• 3.结果与讨论
• 3.1 Resource Q离子柱纯化
• 3.2 HP Sephacryl S-200和Superdex G 75 HR 10/30凝胶过滤纯化
• 3.3 TBa、TDb的电洗脱纯化
• 3.4 回收蛋白含量的测定
• 3.5 TBa、TBb、TBC蛋白等电点测定
• 4.小结
• 第三章 几种特异蛋白免疫活性分析
• 1.材料与试剂
• 2.实验方法
• 2.1 实验前处理
• 2.2 温育
• 2.3 显色
• 2.4 数据分析
• 3.结果
• 3.1 ELISA检测数值
• 3.2 人IgE标准曲线制作
• 3.3 病人血清IgE含量计算
• 3.4 纯化各蛋白抑制率
• 第四章 苦荞过敏性贮藏蛋白全长cDNA的克隆及其分析
• 1.材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要的酶及生化试剂
• 1.3 引物
• 2.方法
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 TBC基因cDNA第一链的合成
• 2.3 苦荞过敏性贮藏蛋白全基因TBc的克隆
• 2.4 PCR产物的纯化
• 2.5 PCR产物的连接与转化
• 2.6 重组子的筛选
• 2.7 重组质粒的提取和鉴定
• 2.8 DNA序列的测定和分析
• 3.结果
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 TBc全基因的克隆
• 3.3 序列测定与分析
• 4.小结
• 第五章 小结及展望
• 1.小结
• 2.展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 承诺书