H5N1亚型HPAIV对鸭的继代感染研究

论文摘要

流行于我国的高致病性禽流感病毒主要分为与地理相关的4个亚群:青海野鸟亚群（WB）、新疆亚群（XJ）、南方水禽亚群（WF）及山西亚群（SX）,各亚群病毒具有各自的基因特征并在对水禽、哺乳动物的致病性上表现各异。鸭因其较强的抵抗力和特殊的饲养模式,已经成为H5N1亚型禽流感病毒的“特洛伊木马”,在HPAIV的传播和进化中扮演了重要作用。本实验从4个亚群的病毒中各选1株代表毒株对鸭和10日龄鸭胚进行继代感染,观察4株病毒各个代次间对鸭的致病性变化以及病毒在鸭体内的复制和排放特点。结果表明:4个亚群病毒对鸭致病性呈现不同的进化特点。野鸟亚群代表株BHG/QH/3/05和新疆亚群代表株CK/XJ/27/06在继代感染过程中对鸭的致病性总体呈减弱趋势:死亡率逐代下降。病毒在脑内复制能力明显降低,其中BHG/QH/3/05在F4代时,3只剖检鸭脑部中均未分离到病毒,CK/XJ/27/06在F4代时,3只剖检鸭中仅从1只中分离到病毒。在排毒方式上,喉头病毒排放量逐代减少,临近排毒结束的第5d,第7d,泄殖腔排毒量逐代提高,BHG/QH/3/05在F4代时,5d泄殖腔排毒量超过喉头排毒量;CK/XJ/27/06在F3代的第3d、5d,F4代的第7d天,泄殖腔排毒超过喉头排毒成为主要的排毒方式。南方水禽亚群代表株DK/GD/12/07始终保持着对鸭的高致病性,从F1代到F4代,都在短时间内全部致死接种鸭,并通过水平传播,10天内致死绝大部分同居鸭,各脏器中病毒滴度和喉头泄殖腔排毒水平都很高,在连续感染的4代中未发生明显变化。山西亚群代表株CK/SX/2/06保持着其对鸭的低致病性,各代次病毒对鸭均不致死,在各脏器中的复制能力很弱,鸭在感染病毒后排毒水平较低且不能通过水平传播感染同居鸭。对4株代表毒株鸭体继代感染的F4代病毒进行全基因组序列测定,并同其F1代进行序列比对,结果表明,各亚群病毒的F1-F4代都出现了氨基酸的改变。4株病毒在10日龄鸭胚中继代感染10代后,F10代对鸭胚和4周龄鸭的致病性与F1代相比无明显差异。CK/SX/2/06对不同日龄鸭胚的致病性研究表明,尽管CK/SX/2/06对3周龄鸭和1日龄雏鸭呈低致病性,但其能够致死10-23日龄鸭胚,对25日龄鸭胚可感染但不致死,为研究该病毒对鸭致病机制提供了基础。筛选出BHG/QH/3/05 F1-F4,与CK/XJ/27/06 F1-F4两组对鸭致病性上存在差异的变异株,为研究病毒对鸭致病性差异的分子基础提供了良好材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 禽流感病毒的形态、结构和化学组成
• 1.2 禽流感病毒的历史和现状
• 1.2.1 禽流感病毒的流行历史
• 1.2.2 我国近年来的AIV 疫情及我国HPAIV 流行毒株的特征
• 1.3 水禽与禽流感病毒
• 1.3.1 水禽在流感传播中的作用
• 1.3.2 禽流感病毒在水禽中的进化
• 1.4 禽流感病毒的宿主特异性
• 1.5 禽流感病毒致病性的分子基础
• 1.5.1 HA 基因与致病性的关系
• 1.5.2 NA 基因与致病性的关系
• 1.5.3 聚合酶复合体基因与致病性的关系
• 1.5.4 NP 基因与致病性的关系
• 1.5.5 M 基因与致病性的关系
• 1.5.6 NS 基因与致病性的关系
• 1.6 本文研究的目的意义
• 第二章 H5N1 亚型HPAIV 对鸭的继代感染研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 实验中常用化学试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 鸡胚半数感染量（EID50）测定
• 2.2.2 SPF 鸭的继代感染试验
• 2.2.2.1 传代毒株的选择
• 2.2.2.2 各代次感染鸭和同居鸭发病死亡情况统计
• 2.2.2.3 鸭感染各代次病毒后各组织器官的病毒滴定
• 2.2.2.4 鸭感染各代次病毒后喉头、泄殖腔拭子的病毒滴定
• 2.2.3 静脉接种指数（IVPI）测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 子代病毒的选择
• 2.3.2 野鸟亚群代表株继代感染结果
• 2.3.2.1 鸭感染 BHG/QH/3/05 各代次病毒后的死亡情况
• 2.3.2.2 BHG/QH/3/05 各代次病毒在组织器官的病毒滴定
• 2.3.2.3 鸭感染 BHG/QH/3/05 各代次病毒后喉头、泄殖腔拭子的病毒滴定
• 2.3.3 新疆亚群代表株继代感染结果
• 2.3.3.1 鸭感染 CK/XJ/27/06 各代次病毒后的死亡情况
• 2.3.3.2 CK/XJ/27/06 各代次病毒在组织器官的病毒滴定
• 2.3.3.3 鸭感染 CK/XJ/27/06 各代次病毒后喉头、泄殖腔拭子的病毒滴定
• 2.3.4 南方水禽亚群继代感染结果
• 2.3.4.1 鸭感染 DK/GD/12/07 各代次病毒后的死亡情况
• 2.3.4.2 DK/GD/12/07 各代次病毒在组织器官的病毒滴定
• 2.3.4.3 鸭感染 DK/GD/12/07 各代次病毒后喉头、泄殖腔拭子的病毒滴定
• 2.3.5 山西亚群继代感染结果
• 2.3.6 各亚群病毒对鸡的IVPI 测定结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 继代感染中传代病毒的选择
• 2.4.2 各亚群病毒在鸭中继代感染的进化特点
• 2.4.3 对鸭致病性的变化同鸭体病毒排放的关系
• 第三章 鸭继代感染中各亚群病毒 F1 代与 F4 代序列分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 参考序列
• 3.2 方法
• 3.2.1 病毒核酸的提取
• 3.2.2 cDNA 的合成
• 3.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
• 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物
• 3.2.5 PCR 产物回收和纯化
• 3.2.6 PCR 回收产物鉴定
• 3.2.7 全基因的序列测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 产物鉴定结果
• 3.3.2 四株代表毒株继代感染后的序列对比
• 3.3.2.1 BHG/QH/3/05（WB）F1-F4 代序列对比
• 3.3.3.2 CK/XJ/27/06（XJ）F1-F4 代序列对比
• 3.3.2.3 DK/GD/12/07（WF）F1-F4 代序列对比
• 3.3.2.4 CK/SX/2/06（SX）序列对比
• 3.4 讨论
• 第四章 H5N1 亚型 HPAIV 在鸭胚中的继代感染研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 10 日龄 SPF 鸭胚的继代感染及 F10 代病毒对 3 周龄鸭的感染试验
• 4.2.2 CK/XJ/2/06 10-25 日龄 SPF 鸭胚的感染试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 各亚群病毒对鸭胚的继代感染实验结果
• 4.3.2 CK/SX/2/06 对不同日龄鸭胚的致病力比较
• 4.4 讨论
• 4.4.1 各亚群病毒在10 日龄鸭胚中的继代感染
• 4.4.2 CK/SX/2/06 对鸭胚致病性同鸭胚日龄关系的讨论
• 第五章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历