稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶在水稻中的功能验证

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）是水稻重要病害稻瘟病的病原菌,也是研究丝状真菌生物学的重要模式生物。植物与病原菌相互作用的过程中,涉及双方许多信号分子的识别与传导。在病原菌方面,这些信号分子往往就是与植物受体蛋白起作用的激发子或其它致病因子。分泌蛋白因其分泌到体外的特性,最有可能是病原菌分泌到细胞外与寄主受体蛋白起作用的激发子和致病因子。很多研究表明稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶很可能是一种潜在的致病因子。在先前的研究中我们认为表达强度较大的稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶基因MGG 07965.5很可能具有比较重要的生物学功能。进一步的生物信息学分析表明:它是一种分泌蛋白,含有一个具有20个氨基酸残基的信号肽序列。本研究反转录测序发现在稻瘟病菌数据库中的丝氨酸蛋白酶基因MGG 07965.5注释为内含子的部分,实际上可能是外显子部分。为了进一步了解丝氨酸蛋白酶对水稻的影响,研究构建了分别含有全长MGG 07965.5和剪切信号肽的MGG 07965.5基因的瞬时表达载体pUPTN-F-07965.5、pUPTN-C-07965.5和过量表达载体pCAMBIA1301-ubi-F-07965、pCAMBIA1301-ubi-C-07965。通过基因枪轰击将瞬时表达载体和1301载体转化水稻品种CO39和其抗稻瘟的近等基因系Pi9（C751）水稻叶片,使其共表达。结果发现在Pi9的水稻叶片中GUS表达量较CO39中的GUS表达量明显降低,但剪切信号肽与否对GUS表达量似乎没有影响。说明稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶基因MGG07965.5很可能是稻瘟病菌的致病基因,它的表达产物可能是引起抗病水稻过敏性反应的激发子之一。本研究还将构建的过量表达载体转化到水稻品种明恢86中,进行组成型表达。分别得到含有全长MGG 07965.5的转基因水稻12株,剪切信号肽的MGG 07965.5基因的转基因水稻16株。收获经生物鉴定呈阳性的植株种子,用于下一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 激发子的分类
• 1.1.1 寡糖
• 1.1.1.1 β-葡七糖
• 1.1.1.2 几丁质（chitin）寡糖和壳寡糖（chitosan）
• 1.1.1.3 寡聚半乳糖醛酸（oligochitoson）
• 1.1.1.4 脂多糖（lipopolysaccharide）
• 1.1.2 肽和蛋白
• 1.1.2.1 激发素（elicitins）
• 1.1.2.2 分泌蛋白（secreted protein）
• 1.1.3 糖蛋白（glycoprotein）
• 1.2 激发子受体
• 1.3 激发子引起的信号传导
• 1.3.1 蛋白质可逆磷酸化作用（The reversible phosphorylation of proteins）
• 1.3.2 活性氧迸发（oxidative burst OXB）
• 1.3.3 G-蛋白（G-protein）信号途径
• 1.3.4 离子流动和膜去极化（ion flow and cell membrane depolarization）
• 1.4 激发子诱导的基因表达
• 1.5 丝氨酸蛋白酶家族
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试水稻品种及病菌菌种
• 2.1.2 供试菌株
• 2.1.3 质粒及载体
• 2.1.4 主要试剂和仪器
• 2.1.4.1 主要试剂
• 2.1.4.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶信号肽的分析
• 2.2.2 引物
• 2.2.3 目的基因的获得
• 2.2.3.1 稻瘟病菌总RNA的提取
• 2.2.3.2 DNaseI处理去除稻瘟病菌基因组DNA
• 2.2.3.3 RT-PCR
• 2.2.3.4 PCR条件的筛选
• 2.2.4 瞬时表达载体的构建
• 2.2.4.1 PCR产物的回收
• 2.2.4.2 PCR产物与T载体的连接
• 2法制备大肠杆菌感受态细胞'>2.2.4.3 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.4.4 热击转化法
• 2.2.4.5 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2.4.6 重组质粒的鉴定
• 2.2.4.6.1 拟转化子PCR鉴定:
• 2.2.4.6.2 拟克隆子的酶切鉴定
• 2.2.4.6.3 克隆子的方向鉴定
• 2.2.4.6.4 基因的序列测定及序列分析
• 2.2.4.7 从T载体上酶切目的片段
• 2.2.4.8 对UPTN载体进行酶切
• 2.2.4.9 酶切产物的回收
• 2.2.4.10 具有突出末端的DNA片段补平
• 2.2.4.11 去磷酸化
• 2.2.4.12 目的片段与载体的连接
• 2.2.4.13 电击感受态细胞的制备
• 2.2.4.14 电击转化
• 2.2.4.15 重组子的鉴定
• 2.2.4.15.1 拟转化子PCR鉴定:
• 2.2.4.15.2 克隆子的方向鉴定
• 2.2.4.15.2.1 连接全长丝氨酸蛋白酶基因的瞬时表达载体的方向鉴定
• 2.2.4.15.2.2 连接剪切信号肽丝氨酸蛋白酶基因的瞬时表达载体的方向鉴定
• 2.2.4.15.3 基因的序列测定及序列分析
• 2.2.5 过量表达载体的构建
• 2.2.5.1 中间载体pBlueKS的酶切回收
• 2.2.5.2 目的片段与载体的连接
• 2.2.5.3 过量表达载体pCAMBIA1301-UbiN的酶切回收
• 2.2.5.4 目的基因在pCAMBIA1301-UbiN中的方向鉴定
• 2.2.5.5 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5.6 电击转化农杆菌
• 2.2.5.7 农杆菌拟转化子的鉴定
• 2.2.6 农杆菌介导法转化水稻
• 2.2.6.1 培养基
• 2.2.6.2 胚性愈伤组织的诱导及继代
• 2.2.6.3 愈伤组织的预培养
• 2.2.6.4 农杆菌的培养及处理
• 2.2.6.5 共培养
• 2.2.6.6 洗除农杆菌
• 2.2.6.7 愈伤组织的筛选
• 2.2.6.8 抗性愈伤组织的继代与植株的再生
• 2.2.6.9 转化率、分化率和共转化率的计算
• 2.2.7 转基因水稻的PCR检测
• 2.2.7.1 水稻叶片PCR模板的制备
• 2.2.7.2 PCR扩增引物序列
• 07965.5基因在水稻叶片中的瞬时表达'>2.2.8 MGG₀7965.5基因在水稻叶片中的瞬时表达
• 2.2.8.1 DNA微弹的制备
• 07965.5基因'>2.2.8.2 在水稻叶片中瞬时表达MGG₀7965.5基因
• 2.2.9 转基因植株的GUS组织化学染色
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因的分析及获取
• 07965.5丝氨酸蛋白酶信号肽预测结果'>3.1.1 MGG₀7965.5丝氨酸蛋白酶信号肽预测结果
• 3.1.2 稻瘟病菌总RNA的提取及检测
• 07965.5克隆与鉴定'>3.1.3 全长MGG₀7965.5克隆与鉴定
• 3.1.4 重组子pMD18-T-F-07965.5-1的测序鉴定
• 07965.5基因的克隆与鉴定'>3.1.5 剪切信号肽后的MGG₀7965.5基因的克隆与鉴定
• 3.1.6 重组子pMD18-T-C-07965.5-2的测序鉴定
• 3.2 瞬时表达载体的构建
• 3.2.1 瞬时表达载体pUPTN-F-07965.5的构建及鉴定
• 3.2.2 瞬时表达载体pUPTN-C-07965.5的构建及鉴定
• 3.3 过量表达载体的构建及鉴定
• 3.3.1 过量表达载体pCAMBIA1301-ubi-F-07965的构建及鉴定
• 3.3.2 过量表达载体pCAMBIA1301-ubi-C-07965的构建及鉴定
• 3.4 过量表达载体转农杆菌及其鉴定
• 3.4.1 过量表达载体p1301-ubi-F-07965转农杆菌及其鉴定
• 3.4.2 过量表达载体1301-ubi-C-07965转农杆菌及其鉴定
• 07965.5基因在水稻叶片中的瞬时表达'>3.5 MGG₀7965.5基因在水稻叶片中的瞬时表达
• 3.6 根癌农杆菌介导水稻转化
• 3.7 转基因水稻的生物学鉴定
• 3.7.1 转基因水稻的PCR检测
• 3.7.2 转基因水稻的组织化学染色
• 4.讨论
• 4.1 稻瘟病菌基因组数据库中的内含子
• 4.2 关于瞬时表达
• 4.3 组培体系的建立
• 4.4 转基因水稻的获取
• 参考文献
• 附录Ⅰ:本研究所用基本培养基配方