水稻（Oryza sativa L.）锌高效营养生理机制研究

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）缺锌作为一种广泛分布的缺素问题,严重限制着水稻产量,锌高效品种是指在缺锌条件下能够维持较好的长势及较高的产量的水稻品种。本论文以水稻锌高效品种（IR8192）及锌低效品种（二九丰）为供试材料,采用螯合剂培养方法,运用叶绿素荧光、低温荧光、透射电镜、生物信息学分析及RT-PCR等技术手段,较系统地对水稻锌高效营养在光合反应、生理及形态响应、ZIP转运子基因表达等方面的机制进行了初步的探讨,取得的主要研究结果如下:1、在潜在缺锌(pZn2+=11.0)条件下,两基因型水稻的总根长、根总表面积、根总体积及总根数等根部参数都出现一定程度的适应性增加,但锌高效品种IR8192相对于对照的增加率要高于低效品种二九丰,IR8192主要通过增加细根数及根总长来适应缺锌条件;在极度缺锌条件下,以上根形态参数则被降低,但二九丰的降低幅度要显著高于IR8192。缺锌首先导致根尖细胞中的质膜及线粒体的超微结构异常,在潜在缺锌条件下,二九丰的根尖中出现许多肿胀的线粒体,但相同条件下IR8192的根尖超微结构则无明显变化;在极度缺锌条件下(pZn2+＞11.5),两品种根尖均出现空泡及质壁分离等严重结构损伤现象。这些结果表明,锌高效品种IR8192在缺锌条件下能够维持结构完整、功能健全的发达根系,这可能是水稻锌高效的重要生理机制之一。2、两个水稻品种根系分泌物中,检测出的低分子量有机酸主要有草酸和柠檬酸,结果显示,缺锌条件显著提高两品种水稻根系草酸分泌量,IR8192在缺锌条件下的根系分泌物中柠檬酸含量要高于对照,而二九丰则呈下降趋势;在缺锌条件下IR8192根部总酚酸及可溶性糖的分泌量亦高于二九丰,表明在缺锌条件下,IR8192根部分泌更大量的有机小分子用于活化根际的锌。在根内,缺锌条件下IR8192苹果酸及柠檬酸与对照的比率均小于二九丰,与此相对的是地上部相对含量均高于二九丰,根据Zn-苹果酸穿梭模型,表明IR8192在缺锌条件下能够更有效地将锌与有机酸的螯合体向地上部运输。柠檬酸脱氢酶及琥珀酸脱氢酶在两品种间均无显著差异,但IR8192根内苹果酸脱氢酶活性则显著高于二九丰,结合植物各部有机酸含量数据,锌高效品种在受缺锌胁迫下,苹果酸脱氢酶（MDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）应该主要是作用在有利于苹果酸合成的方向,并结合更多的锌向植物地上部运输。3、随着锌离子活度的下降,细胞膜脂过氧化加重,其中二九丰的膜脂过氧化更为严重;缺锌处理对二九丰的H2O2含量、质膜透性及游离脯氨酸含量的增幅亦显著高于IR8192,表明二九丰所受氧化胁迫程度要高于IR8192。缺锌处理后IR8192内抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和氧化物歧化酶（SOD）的酶活性普遍高于二九丰,表明IR8192作为锌高效品种,与二九丰相比,在缺锌条件下能够保持更高的抗氧化酶酶活,使体内活性氧自由基引起的氧化胁迫保持在较低水平,进而维系植物的正常代谢功能,这可能是IR8192内锌高效营养的重要机制之一。4、缺锌显著降低两水稻品种叶片中的叶绿素含量、叶绿素a/b比率、净光合速率、Fv/Fm及Fv/Fo值,表明光系统Ⅱ的内部结构已经受到破坏。与锌高效品种IR8192相比,二九丰的以上参数在缺锌处理下的降低比率要更大。77K低温荧光光谱亦显示,缺锌条件阻碍了IR8192光系统Ⅱ向光系统Ⅰ传递的激发能,但相同条件下二九丰的光谱不成谱形,表明此时二九丰的光合中心已经受到严重损伤。透射电镜显示,缺锌引起叶片叶绿体超微结构的异常,但在相同的缺锌水平下,IR8192能够保持比二九丰更完整的叶绿体超微结构。这些结果表明,缺锌首先引起叶片光合单位的减少,同时光合单位的光合能力也受到抑制,锌高效品种则能在缺锌条件下保持较低效品种更多的光合单位及更高效的光合能力。5、ZIP（ZRT,IRT-like protein）家族是广泛存在于动植物中的转运蛋白,具有锌、铁、铜等多种过渡金属元素转运功能。基于隐马可夫模型（hidden Markovmodel,HMM）与BLAST比对,对水稻全基因组ZIP家族的17个成员进行了较为系统的研究,并利用RT-PCR分析比较了它们在不同锌效率水稻中的表达差异。序列分析表明,该家族成员分布在8条染色体上,大多数成员具有ZIP家族的典型二级结构特征,但DNA序列存在较大差异。不同锌活度下、不同锌效率水稻中的表达模式研究表明,多个转运蛋白具有表达组织特异性,如OsZIP1（只是在根系中表达）,OsZIP5（,只在花序中表达）;OsZIP8（在根部及花序中表达）、OsZIP9（根部及地上部,不包括花序）、OsZIP13（根部及花序）、OsZIP14（地上部）、OsZIP15（根部及花序）;在缺锌条件下,OsZIP1、OsZIP2、OsZIP3、OsZIP4、OsZIP6、OsZIP7及OsZIP14的表达在两品种或单个品种的表达得到上调,预示着它们可能是水稻中与锌营养相关的转运子;OsIRT1、OsZIP3、OsZIP4、OsZIP6、OsZIP11、OsZIP15在IR8192根部的表达要明显强于二九丰,表明它们可能与存在于IR8192中的高效锌转运系统有关。

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第一部分文献综述

1 土壤中的锌

1.1 土壤锌含量及分布规律

1.2 土壤中的有效锌

1.3 影响土壤有效锌的因素

2 锌对高等植物的营养功能

2.1 植物对锌的吸收及累积

2.2 锌在植物体内的存在形态

2.3 酶的重要组成

2.4 参与酶的活化

2.5 影响DNA和RNA及蛋白质的合成

2.6 参与碳水化合物的代谢

2.7 参与色氨酸和吲哚乙酸的合成

3 水稻缺锌的分布

3.1 水稻缺锌的广泛性

3.2 水稻锌营养失调的症状

4 水稻锌营养基因型差异及其生理基础

4.1 水稻锌营养基因型差异

4.2 水稻锌营养基因型差异的生理基础

5 水稻锌营养的分子机制

5.1 ZIP转运子家族

5.2 CDF转运子家族

5.3 水稻中的锌转运子及其调控

6 论文研究目的、意义、内容及思路

6.1 研究目的及意义

6.2 研究内容与技术路线

第二部分试验研究

第一章水稻锌高效营养与根部形态及超微结构的关系研究

1.1 前言

1.2 材料与方法

1.2.1 供试材料

1.2.2 植物培养与缺锌处理

1.2.3 锌含量测定及根系形态参数测定

1.2.4 透射电镜

1.2.5 根系活力的测定

1.2.6 数据处理

1.3 试验结果

1.3.1 不同缺锌水平对植株锌含量的影响

1.3.2 缺锌条件对不同锌效率水稻生长的影响

1.3.3 缺锌条件对不同锌效率水稻根系活力的影响

1.3.4 缺锌条件对不同锌效率水稻根系形态的影响

1.3.5 缺锌条件对不同锌效率水稻根尖超微结构的影响

1.4 讨论

第二章水稻锌高效营养与根系分泌物代谢关系

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 试验处理

2.2.2 根系分泌物的收集及分离

2.2.3 根系分泌物的测定

2.2.4 根尖有机酸代谢相关酶活性的测定

2.3 结果与分析

2.3.1 缺锌对水稻根内有机酸的影响

2.3.2 缺锌对水稻地上部有机酸含量的影响

2.3.3 根系分泌物测定

2.3.4 缺锌对根系内有机酸代谢酶的活性的影响

2.4 讨论

第三章水稻锌高效营养与氧化胁迫及抗氧化酶系统的关系研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 植物培养与缺锌处理

3.2.2 质膜透性

3.2.3 游离脯氨酸含量

2O₂含量'>3.2.4 H₂O₂含量

3.2.5 MDA含量

3.2.6 SOD酶活测定

3.2.7 POD酶活测定

3.2.8 CAT酶活测定

3.2.9 APX酶活测定

3.3 试验结果

3.3.1 丙二醛含量

3.3.2 过氧化氢含量

3.3.3 游离脯氨酸含量

3.3.4 质膜透性

3.3.5 抗氧化酶活性

3.4 讨论

第四章缺锌条件对不同锌效率水稻（Oryza sativa L.）光合能力、77K低温荧光及叶绿体超微结构影响

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 试验材料

4.2.2 植物培养与缺锌处理

4.2.3 生物量测定与锌含量分析

4.2.4 叶绿素含量测定

2浓度的测定'>4.2.5 植株叶片净光合速率、气孔导度和胞间CO₂浓度的测定

4.2.6 叶绿素荧光的测定

4.2.7 77K低温荧光测定

4.2.8 叶绿体超微结构

4.3 试验结果

4.3.1 植物生物量生长

4.3.2 植物叶片内锌含量

4.3.3 叶绿素含量

2浓度的测定'>4.3.4 净光合速率、气孔导度和胞间CO₂浓度的测定

4.3.5 叶绿素荧光

4.3.6 77K低温荧光

4.3.7 叶绿体超微结构

4.4 讨论

4.4.1 缺锌对不同锌效率水稻光合速率及叶绿体光合色素的影响

4.4.2 叶绿素荧光光谱及77K低温荧光光谱显示缺锌对光反应中心造成了破坏

4.4.3 叶绿体超微结构显示缺锌胁迫对不同锌效率水稻的叶绿体结构具有不同影响

第五章 ZIP锌转运子的基因组学分析及其在不同锌效率水稻中的表达模式研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 植物ZIP HMM profile的建立与数据库搜索

5.2.2 序列联配和系统发生学分析

5.2.3 半定量RT-PCR

5.3 试验结果

5.3.1 植物生物量生长

5.3.2 水稻基因组中ZIP基因家族成员的鉴定及染色体定位

5.3.3 ZIP转运蛋白的保守结构域与系统进化分析

5.3.4 OsZIP家族基因在不同锌效率水稻各组织中表达模式

5.4 讨论

第六章综合结论、创新点与研究展望

6.1 综合结论与讨论

6.1.1 与根部相关的锌高效机制

6.1.2 对锌的吸收转运上的锌高效机制

6.1.3 与地上部生理和锌生物有效性相关机制

6.2 主要创新点

6.3 研究展望

Abstract

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的主要科研成果

水稻（Oryza sativa L.）锌高效营养生理机制研究

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