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键合表阿霉素纳米胶束肝动脉灌注靶向治疗大鼠移植性肝癌的实验研究

2020-12-11阅读(758)

键合表阿霉素纳米胶束肝动脉灌注靶向治疗大鼠移植性肝癌的实验研究

论文摘要

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有起病隐袭、恶性程度高、复发率高等特点,早期诊断困难,手术切除率低,故临床上化学疗法仍是目前常用的治疗手段。传统的小分子化疗药物缺乏对肿瘤组织的特异性,间断性的冲击化疗在杀死肿瘤细胞的同时,也会对正常组织产生毒副作用,并易导致肿瘤细胞耐药性的产生,远期疗效并不满意。因此,以提高药效和降低药物副作用为目的的纳米靶向控释系统在肝癌化学疗法中的应用,逐渐成为国内外学者研究的热点。表阿霉素（EPI）是蒽环类抗癌抗生素的新成员,目前在临床上已逐渐代替阿霉素（ADM）,成为肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的一线用药。本实验以EPI为前体药物,选择具有肿瘤靶向呈递作用的聚乙二醇-b-聚乳酸-co-碳酸酯聚合物（PEG-b-P（LA-co-DHP））为载体材料,采用透析法制备化学键合的载表阿霉素纳米胶束（EPI-NPs）,研究EPI-NPs在体外的释药特点及对Walker-256瘤株的增殖抑制作用,并初步探讨了EPI-NPs诱导Walker-256细胞凋亡的机制；以Walker-256肿瘤细胞直接注射法建立大鼠移植性肝癌模型,采用类似介入治疗的肝动脉灌注给药,研究EPI-NPs在大鼠体内的分布特点及药效,并进一步探讨了EPI-NPs在大鼠体内的靶向控释机制,为其临床应用提供理论依据。研究目的：制备具有靶向控释作用的EPI-NPs,研究EPI-NPs在体内及体外的控释作用及抑瘤效果,探讨纳米载药体系的靶向控释机制和抑瘤机制,为肝癌的靶向治疗提供一种新的途径。研究方法：1.应用透析法制备化学键合的EPI-NPs,测定和表征其形貌、粒径及粒径分布等理化性质,检测其体外释放并绘制体外释放曲线。2.体外培养Walker-256细胞,以EPI为对照,激光共聚焦显微镜检测Walker-256细胞对EPI-NPs的摄取情况,MTT法、流式细胞仪检测EPI-NPs对Walker-256细胞增殖、凋亡及细胞周期的作用,RT-PCR及Western blot法检测EPI-NPs诱导Walker-256细胞凋亡的相关基因在mRNA及蛋白水平表达的影响,初步探讨EPI-NPs的控释作用及抑瘤机制。3.①分别用瘤块嵌插法和直接注射法建立Walker-256细胞株大鼠移植性肝癌模型,对比分析两种方法的优缺点并探讨肝移植性肿瘤的血供特点,为体内药物试验奠定基础。②模拟介入治疗手段将EPI-NPs以肝动脉灌注的方式注入模型鼠,利用EPI本身自带荧光的特点,采用组织荧光和匀浆荧光技术观察EPI-NPs在肝荷瘤大鼠体内的分布规律及特点并与EPI小分子药进行对比分析。③药效实验：考察EPI-NPs开动脉灌注对大鼠移植性肝癌的体积抑瘤率、质量抑瘤率的影响,并分析其对大鼠生存率的影响,探讨EPI-NPs的体内抑瘤机制。结果：1. EPI-NPs的制备：（1）应用透析法获得化学键合的EPI-NPs呈均一的球状结构,临界胶束浓度（CMC）为8.27mg/L,动态光散射（DLS）测得胶束的平均粒径为86nm,载药量为14.7%；（2）体外释放实验表明,键合药对酸敏感,释放率随pH值的降低而升高,药物于pH 5.0的环境中9d内几乎全部释放,而在pH 7.4条件下20d仅释放10%左右。2.体外抑瘤实验：（1）激光共聚焦显微镜观察表明EPI-NPs在Walker-256细胞内的含量要明显高于EPI,且细胞内药物含量随时间的延长而增加；（2）MTT结果表明,与游离的EPI比较,EPI-NPs对Walker-256细胞株增殖的抑制作用更明显,随药物作用时间的增加及浓度的增高,抑制率逐渐增高；（3）流式细胞学检测表明EPI及EPI-NPs均可诱导walker-256细胞凋亡,并使细胞周期阻滞于G2／M期,EPI-NPs诱导细胞凋亡的作用要强于EPI。（4） RT-PCR及Western blot结果表明,在EPI-NPs作用下,Walker256细胞p53基因在mRNA和蛋白水平均出现表达上调,而bcl-2基因则表达下调。3.体内药物分布及药效实验：（1）动物模型的建立：采用瘤块嵌插法和直接注射法建立大鼠移植性肝癌模型成瘤率均可达到100%,荷瘤鼠存活时间无明显区别；与瘤块嵌插法相比,直接注射法操作简单,成瘤周期短,仅需8d,更适合用于样本量需求较大的体内药物试验动物模型的建立。（2）药物的体内分布实验：①药物的肝内分布：EPI-NPs组肿瘤组织荧光强度在各时间点均明显高于正常肝组织,而EPI组除了5mmin外的其它各时间点均表现为平均分布；②药物的全身分布：除心和脑外,EPI-NPs组药物荧光在大鼠全身组织的分布强度明显高于EPI组；EPI-NPs组的药物荧光组织分布呈现了肿瘤>肝>脾、肺、肾>心>脑的梯度变化规律,而EPI组表现为平均分布；③EPI-NPs经肝动脉灌注后,除脑组织外,体内各重要组织均在15min和2h左右分别出现两个药物荧光分布高峰,表现出有趣的“双峰现象”。（3）药效实验：EPI-NPs组大鼠的生存率及肝移植瘤的体积抑瘤率、质量抑瘤率均优于EPI组。结论：1.经PEG修饰的PEG-b-P（LA-co-DHP/NPC）胶束具有良好的生物相容性和亲水性,利用酸降解的腙键共价连接EPI使其智能化后,具有被动靶向性和pH靶向性,保证了键合药良好的缓释性和细胞内靶向作用。2.EPI-NPs具有良好的细胞内缓释性,其抑瘤机制可能是通过mRNA及蛋白水平上调p53和下调bcl-2而诱导细胞凋亡,同时使细胞周期阻滞于G2/M期来实现的。3.肝动脉灌注给药实现了EPI在大鼠的肝内及全身的重分布,改变了EPI的分布代谢规律,增加了药物在靶位的生物利用度,并可能减轻心脏毒性。4.药物荧光强度在肝内出现的“双峰”现象,延长了药物的作用时间,增加了肝及肿瘤的药物分布比例,有利于肿瘤的治疗。5. EPI-NPs对大鼠移植性肝癌具有良好的抑制效果。综上,我们利用EPI-NPs其自身具有的被动靶向和pH靶向的双重靶向特点,结合Walker-256肝转移癌的血供特点,采用肝动脉灌注的给药方式,实现了EPI-NPs在大鼠模型体内的靶向控释过程,提高了EPI的生物利用度,为肝癌等恶性肿瘤的药物靶向治疗提供了新的途经。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 英文缩略词
  • 第1章 绪论
  • 1.1 肿瘤的靶向治疗策略
  • 1.1.1 常规化疗药物面临的挑战
  • 1.1.2 靶向治疗及靶向治疗的种类
  • 1.1.3 载体靶向治疗的实现
  • 1.1.4 小结
  • 1.2 纳米控释系统在肿瘤靶向治疗中的研究进展
  • 1.2.1 纳米、纳米载药体系及纳米控释系统
  • 1.2.2 纳米载药体系的类型
  • 1.2.3 生物降解高分子
  • 1.3 纳米靶向控释系统在肝癌治疗中的应用
  • 1.3.1 被动靶向
  • 1.3.2 主动靶向
  • 1.3.3 基因治疗
  • 1.3.4 问题与展望
  • 1.4 表阿霉素的抗肿瘤机制
  • 1.4.1 细胞凋亡
  • 1.4.2 表阿霉素与基因调控
  • 1.5 立题依据及创新
  • 第2章 键合表阿霉素纳米胶束的制备和表征
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 主要试剂
  • 2.1.2 实验耗材
  • 2.1.3 主要仪器及测试方法
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 应用透析法制备化学键合的表阿霉素纳米胶束
  • 2.2.2 荧光光谱测量临界胶束浓度
  • 2.2.3 DLS测定胶束粒径
  • 2.2.4 电子显微镜表征胶束形貌
  • 2.2.5 分析担载表阿霉素纳米胶束的载药量
  • 2.2.6 检测EPI-NPs体外释放情况
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 荧光光谱测量PEG-b-P（LA-co-DHP）的CMC
  • 2.3.2 扫描电镜和DLS观察测定EPI-NPs形貌、粒径及分布
  • 2.3.3 键合药纳米胶束中EPI的体外释放
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 EPI键合药的修饰特点
  • 2.4.2 纳米胶束合成及表征情况
  • 2.4.3 结论
  • 第3章 键合表阿霉素纳米胶束抗Walker-256细胞株的体外研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 主要试剂
  • 3.1.2 实验耗材
  • 3.1.3 主要仪器
  • 3.1.4 培养用液及实验用液的制备
  • 3.1.5 实验方法
  • 3.1.6 统计学处理
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 Walker-256细胞对EPI-NPs的摄取情况
  • 3.2.2 EPI-NPs对Walker-256细胞增殖的抑制作用
  • 3.2.3 流式细胞仪检测EPI-NPs对Walker-256细胞凋亡和细胞周期的影响
  • 3.2.4 细胞凋亡相关基因转录水平的变化
  • 3.2.5 Western blot检测bcl-2、p-53等凋亡相关蛋白表达变化
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 EPI-NPs对Walker-256肿瘤细胞的抑制及其细胞内靶向和控释作用
  • 3.3.2 EPI-NPs诱导Walker-256肿瘤细胞凋亡和细胞周期的改变
  • 3.3.3 EPI-NPs诱导Walker-256肿瘤细胞凋亡的分子机制
  • 3.3.4 结论
  • 第4章 键合表阿霉素纳米胶束靶向治疗大鼠移植性肝癌的体内实验研究
  • 第1部分 大鼠移植性肝癌模型的建立
  • 4.1 实验对象及材料
  • 4.1.1 肿瘤株
  • 4.1.2 传代鼠
  • 4.1.3 肝癌模型鼠
  • 4.1.4 实验器材
  • 4.1.5 测量仪器
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 Walker-256瘤株复苏及传代
  • 4.2.2 大鼠移植性肝癌模型的制作
  • 4.2.3 观察指标
  • 4.2.4 结果分析
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 肿瘤观察组两种移植方法的比较
  • 4.3.2 生存观察组两种移植方法的比较
  • 4.4 讨论
  • 4.4.1 Walker-256瘤株的生物学特点
  • 4.4.2 传代大鼠腹水生成和肝脏肿瘤接种的影响因素
  • 4.4.3 直接注射法与瘤块嵌插法的比较
  • 4.4.4 结论
  • 第2部分 键合表阿霉素在移植性肝癌大鼠的体内分布及药效考察
  • 5.1 实验对象及材料
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 Walker-256瘤株的复苏和传代
  • 5.2.2 直接注射法制作肝癌模型
  • 5.2.3 肝动脉灌注
  • 5.2.4 药物体内分布的考察
  • 5.2.5 药效考察
  • 5.2.6 结果分析
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 药物分布实验
  • 5.3.2 药效观察
  • 5.4 讨论
  • 5.4.1 肝癌皮下移植模型和原位移植模型的比较
  • 5.4.2 纳米靶向控释系统的提出
  • 5.4.3 被动靶向机制和EPR效应
  • 5.4.4 实验设计方案的提出
  • 5.4.5 EPI-NPs的肝动脉灌注实现了药物在大鼠肝内的重分布
  • 5.4.6 EPI-NPs实现了药物在全身组织的重分布
  • 5.4.7 EPI-NPs缓释作用的体现
  • 5.4.8 EPI-NPs的药效分析
  • 5.4.9 体内实验的不足之处
  • 5.5 结论
  • 参考文献
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果
  • 作者简介
  • 科研成果
  • 致谢

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