卵巢癌血管生成拟态及其相关分子机制的初步研究

论文摘要

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中位于第三位,死亡率高居妇科恶性肿瘤的首位。大量研究结果证实,卵巢癌的生长、浸润和转移过程都依赖于肿瘤血管的形成。从传统意义上讲,肿瘤血管新生有两种方式:血管发生和血管生成。人们一直认为血管生成是肿瘤获得血液供应的唯一途径,直到1999年Maniotis等在研究人眼葡萄膜黑色素瘤微循环的过程中发现了一种全新的肿瘤血液供应模式—血管生成拟态（VM）。目前卵巢癌VM对卵巢癌患者预后的影响及形成的分子机制仍不十分清楚。因此,为了观察卵巢癌中血液供应模式并探讨其与卵巢癌临床病理资料及患者转移和预后之间的关系,进一步阐明卵巢癌VM形成的分子机制,本研究收集了84例卵巢癌组织标本,并应用了SKOV-3和OVCAR-3两种卵巢癌细胞系,深入探讨了VEGF-a对卵巢癌细胞侵袭、迁移和VM形成的影响,及VEGF-a对卵巢癌VM形成中的EphA2/MMPs信号传导途径的影响。主要研究内容包括如下三部分:卵巢癌的血液供应模式及其与临床病理特征的关系。本部分实验观察到在卵巢癌组织中存在内皮依赖性血管、马赛克血管（MBV）和VM三种血液供应模式。在本部分实验中,84例卵巢癌组织标本按照有无VM被分为两组,其中VM（+）组36例,VM（-）组48例。结果表明卵巢癌VM形成的机率与卵巢癌的临床FIGO分期、有无转移、组织学类型和病理学分级密切相关（P＜0.01）,而与患者的年龄、肿瘤的大小以及有无腹水无关（P＞0.05）。即卵巢癌VM形成的机率随着肿瘤分化程度降低,肿瘤恶性程度升高,而明显增高。VM结构的特殊性促进了肿瘤细胞的血道转移,VM（+）组的卵巢癌患者出现转移的机率明显大于VM（-）组,Kaplan-Meier生存分析结果表明其预后比VM（-）组患者的预后要差,两者之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明VM可以作为评价卵巢癌患者预后的一个重要指标。细胞因子对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力和VM形成及其相关信号分子表达的影响。免疫组化染色结果显示VM（+）组VEGF阳性表达率明显高于VM（-）组,差异有统计学意义（P＜0.05）。体外侵袭实验表明VEGF-a能够明显增强卵巢癌细胞的体外侵袭能力。划痕实验结果表明:卵巢癌细胞经细胞因子诱导后,其迁移能力明显增强。免疫组化染色结果显示VM（+）组和VM（-）组卵巢癌组织中的EphA2阳性表达率存在差异,VM（+）组EphA2阳性表达率明显高于VM（-）组,差异有统计学意义（P＜0.05）。Real-time PCR和Western blot实验结果表明:VEGF-a组卵巢癌细胞的EphA2和VE-cadherin mRNA和蛋白水平表达均明显高于不能形成网络样结构的对照组,提示EphA2和VE-cadherin可能是卵巢癌VM形成过程中的重要分子。体外实验表明:VEGF-a组卵巢癌细胞,其MMP-2和MMP-9的活性均明显增强,与细胞的侵袭和迁移能力呈正相关,且该组细胞在三维培养中能形成明显的VM样网状结构。这说明VEGF-a能明显增加卵巢癌细胞及间质细胞的金属蛋白酶的分泌,通过降解基底膜和细胞外基质,增强卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力,使肿瘤细胞易于移出,有利于卵巢癌的转移,并促进卵巢癌VM的形成。VEGF-a在卵巢癌细胞VM形成中对EphA2/MMPs信号传导途径的影响。Real-time PCR和Western blot实验结果表明:siRNA干扰后两种卵巢癌细胞S-组细胞EphA2的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,且两种卵巢癌细胞相应组的EphA2和VE-cadherin的mRNA和蛋白表达水平基本相似。与S-组相比,添加了VEGF-a的S+组卵巢癌细胞的EphA2 mRNA和蛋白表达水平明显上调（P＜0.05）。明胶酶谱检测结果表明:转染pGCSi-EphA2质粒后两种卵巢癌细胞MMP-2和MMP-9的活性均明显下调,在SKOV-3细胞MMP-9的活性下调明显,而在OVCAR-3细胞MMP-2的活性下调明显。在siRNA干扰后,与S-组相比,添加了VEGF-a的S+组的MMF-2和MMF-9的活性表达仍略有上调,但差异无统计学意义。三维培养结果显示:培养10天时在S+组,即便是SiRNA干扰了EphA2的表达,但由于在培养基中添加了VEGF-a,仍能观察到明显的网络样结构形成。在S-组未观察到明显的卵巢癌细胞彼此连接形成的网络样结构。综上所述,本研究观察到卵巢癌中存在内皮依赖性血管、MBV和VM三种血液供应模式,且具有VM的卵巢癌易发生转移,预后差,生存期短于无VM的卵巢癌患者。卵巢癌形成VM的能力与其组织学分级有关,分化程度越低形成VM的能力越强。VEGF-a能明显增强卵巢癌细胞侵袭、迁移能力和形成VM的能力,VEGF-a是卵巢癌VM形成中的重要细胞因子,并通过siRNA干扰,进一步明确了VEGF-a是通过上调EphA2/MMPs通路来促进VM形成的,本研究结果为卵巢癌的抗血管基因治疗提供了新的实验依据和作用靶点。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、卵巢癌的血液供应模式及其与临床病理特征的关系
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、细胞因子对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力和VM形成及其相关信号分子表达的影响
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、VEGF-a在卵巢癌细胞VM形成中对EphA2/MMPs信号传导途径影响
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 胚胎血管发生及内皮分化的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢