谷氨酸消旋酶的加强表达及其对聚γ-谷氨酸合成的影响

论文摘要

聚γ-谷氨酸（poly y-glutamic acid,简写γ-PGA）是由微生物合成的一种高分子水溶性多聚氨基酸,由L-谷氨酸和/或D-谷氨酸单体之间通过a-氨基和γ-羧基以肽键形式形成,在化妆品、食品、农业、医药行业和许多其他领域有着广泛的应用。然而,聚γ-谷氨酸的手性构型往往影响到产品的性能和应用。本研究克隆了地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02中谷氨酸消旋酶的编码基因glr,并在地衣芽胞杆菌WX-02中表达。摇瓶发酵实验结果显示：在B.licheniformis WX-02中表达谷氨酸消旋酶不仅将聚γ-谷氨酸的产量提高了22.5%,而且使聚γ-谷氨酸中D-Glu的比例由77%增加至85%。整个发酵过程中,含有表达质粒pHY300PLK-P43-g/r的重组B. licheniformis WX-02谷氨酸消旋酶的酶活始终高于原始菌株。这是首次报道在地衣芽胞杆菌生产聚γ-谷氨酸过程中谷氨酸消旋酶参与了L-到D-谷氨酸的转化,而且在B. licheniformis WX-02中表达谷氨酸消旋酶可以同时提高聚γ-谷氨酸产量和D-Glu在聚γ-谷氨酸中的比例。本研究构建了一个谷氨酸消旋酶的敲除载体pDG780-194orits-Kan-AB,通过电转化的方法导入B. licheniformis WX-02中。PCR验证表明单交换成功,然而其谷氨酸消旋酶缺失的突变株始终无法筛选得到。此外,本研究还克隆了B. licheniformis WX-02中谷氨酸脱氢酶的编码基因gdh,并在B. licheniformis WX-02中表达。摇瓶发酵实验结果显示：在B. licheniformis WX-02中表达谷氨酸脱氢酶,聚γ-谷氨酸的产量没有提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 聚γ-谷氨酸的简介
• 1.1.1 聚γ-谷氨酸的结构和性质
• 1.1.2 合成聚γ-谷氨酸的微生物
• 1.2 聚γ-谷氨酸的应用
• 1.2.1 聚γ-谷氨酸的应用
• 1.2.2 聚-γ-D-谷氨酸的应用
• 1.2.3 聚-γ-L-谷氨酸的应用
• 1.3 聚γ-谷氨酸的合成与调控
• 1.3.1 聚γ-谷氨酸合成机制模型
• 1.3.2 聚γ-谷氨酸合成酶系及其基因
• 1.3.3 聚γ-谷氨酸的立体构型调控机理
• 1.4 谷氨酸消旋酶
• 1.4.1 谷氨酸消旋酶的性质,结构及种类
• 1.4.2 谷氨酸消旋酶Glr与YrpC
• 1.5 谷氨酸脱氢酶
• 1.6 研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 培养基、培养温度及抗生素使用浓度
• 2.1.4 工具酶及试剂
• 2.1.5 主要溶液的配制
• 2.1.6 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 核酸水平操作
• 2.2.2 重组质粒转化
• 2.2.3 谷氨酸消旋酶基因的克隆以及表达载体的构建
• 2.2.4 谷氨酸消旋酶敲除载体的构建
• 2.2.5 谷氨酸脱氢酶基因的克隆以及表达载体的构建
• 2.2.6 摇瓶发酵培养条件
• 2+,Zn²⁺浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响'>2.2.7 Mn²⁺,Zn²⁺浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响
• 2.2.8 分析方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 谷氨酸消旋酶基因的克隆以及表达载体的构建
• 3.1.1 谷氨酸消旋酶基因的克隆
• 3.1.2 谷氨酸消旋酶表达载体的构建
• 3.2 谷氨酸消旋酶的加强表达对聚γ-谷氨酸发酵的影响
• 3.2.1 谷氨酸消旋酶在地衣芽胞杆菌WX-02中的表达
• 3.2.2 谷氨酸消旋酶的加强表达对聚γ-谷氨酸产量的影响
• 3.2.3 谷氨酸消旋酶的加强表达对聚γ-谷氨酸中D/L-Glu比例的影响
• 3.3 谷氨酸消旋酶缺失菌株的构建
• 3.3.1 谷氨酸消旋酶敲除载体的构建
• 3.3.2 谷氨酸消旋酶缺失菌株的筛选
• 2+,Zn²⁺浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响'>3.4 Mn²⁺,Zn²⁺浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响
• 2+浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响'>3.4.1 Mn²⁺浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响
• 2+浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响'>3.4.2 Zn²⁺浓度对聚γ-谷氨酸发酵的影响
• 3.5 谷氨酸脱氢酶基因的克隆以及表达载体的构建
• 3.5.1 谷氨酸脱氢酶基因的克隆
• 3.5.2 谷氨酸脱氢酶表达载体的构建
• 3.6 谷氨酸脱氢酶的加强表达对聚γ-谷氨酸发酵的影响
• 4. 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文