论文摘要
研究背景：钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是目前所知唯一一种受Ca2+/CaM（calmodulin，钙调素）调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，又称蛋白磷酸酶2B（PP2B），它的分子结构非常保守，从酵母到人类，其氨基酸结构序列均有很高的同源性。它是由一个催化亚基（CnA）和一个调节亚基（CnB）组成的二聚体，CnA具有和CaM结合的位点，而Ca2+则通过与CnB结合增加该酶的活性。人类的CnA有CnAα、CnAβ、CnAγ3种异构体，其中CnAγ是睾丸中特有的，CnAα和CnAβ则存在于机体其它大部分组织器官中。活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NF-AT）是目前所知CaN重要的活性底物，在细胞浆中它能够被活化的CaN去磷酸化后移位至细胞核中，与其他因子相互作用参与调节转录活性和多种基因的表达。免疫抑制剂环孢菌素A（Cylosporine A，CsA）和FK506可以通过与细胞质内各自的亲免素蛋白（环孢亲和素A和FKBP12）结合而抑制CaN的活性。目前已知CaN广泛存在于哺乳动物的多个组织，通过多种信号通路参与许多细胞功能的调节。其生物学作用有：①参与刺激T细胞活化过程中多种细胞因子的生成和趋化因子的表达，最终导致T细胞活化和免疫功能的获得。②参与调节神经递质和激素的释放，神经突触的生长发育、可塑性和效率方面，还与学习记忆和老年痴呆有关。③参与细胞生长与细胞调亡。④在心血管系统参与心脏正常形态的发生、血管平滑肌细胞增殖、调节内皮细胞功能和心肌细胞调亡以及各种原因引起的心肌肥厚。⑤在其他系统中CaN也发挥着重要作用如：参与近端及远端肾单位Na+/K+ATP酶的活性调节；参与抑制白血病细胞HL-60的增值和中性粒细胞活动的调节；促进骨的重吸收，调节破骨细胞的功能并参与骨骼肌的肥大等。CaN最早在哺乳动物的脑内纯化，是脑内含量最高的蛋白之一，占脑组织蛋白的1％以上，主要分布在神经组织、T淋巴细胞、心肌、骨骼肌、肺、脾脏、肝脏等细胞的细胞浆内质网中。在神经组织中，CaN分布具有明显的区域性，大量存在于重要的突触调控部位，中枢系统中CaN在海马、豆状核、尾状核、和黑质最多，小脑和新皮质的Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ层次之，也见于脊髓。心肌组织中的CaN最早由Wolf H等从牛的心肌中分离纯化，随后人们又应用兔抗牛CaN抗体在牛心肌和骨骼肌匀浆组织中检测到CaN两种亚基的存在。目前许多实验证明CaN在心脏组织中有表达，其活化后可以通过CaN-NFAF等多种信号通路参与心肌肥厚的发生与发展，但是它具体存在心脏组织的何种细胞中还没有相关报道。通过了解CaN在心脏组织各细胞中的分布，可以进一步帮助了解CaN在心血管疾病发生中的作用，特别是在心肌肥厚中的发生机制有重要的意义。本研究目的：探讨CaN在心脏组织细胞中的分布。研究方法：研究对象为入住山东省立医院患有二尖瓣狭窄和关闭不全并需要进行瓣膜置换手术的患者，手术中取其小块（5×5×5mm）左心室乳头肌（5例），同时以1例非心源性死亡者作为对照，将标本制作成冰冻切片并做好标记。所有入选者术前均未曾服用过CaN抑制剂（如CsA、FK-506）。①通过苏木精-伊红染色，了解心脏组织中各种细胞的一般分布情况；②应用免疫组织化学技术，观察加入CaN抗体后心脏各种细胞的染色情况。取相同心肌组织的连续切片，在结合第一抗体的时候，以用相同体积的一抗缓冲液代替一抗用来做对照。通过AEC显色来对比实验组和对照组最后的染色情况，并分析心肌组织中CaN在各种细胞的分布。结果：一抗稀释滴度效果评价为，切片标本滴加稀释浓度为1：100的抗体AEC染色后的效果较其他稀释浓度的抗体好。免疫组织化学分析显示：无论患者是否患有心脏疾病，在其心肌细胞、心肌成纤维细胞以及间皮细胞均有阳性染色反应，而血管平滑肌细胞中未见相同染色。当以一抗缓冲液替代一抗的切片，其相应部位相应细胞中没有看到相应的染色。结论：CaN在心肌组织中主要分布于心肌细胞、心肌成纤维细胞、间皮细胞，心脏血管平滑肌细胞中未见表达。提示它可能与心肌组织的肥厚有关。其在间皮细胞中作用还不清楚，有待进一步研究。