STAT3特异性短干涉RNA抑制神经胶质瘤细胞增殖的研究

论文摘要

目的:探讨在STAT3基因不同的结构域选择干涉靶点制备的siRNA对大鼠神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法:针对STAT3编码区的三个不同结构域SH2、CCD和TAD各分别选择一段序列,在体外构建短发夹结构,连到人U6启动子后,克隆到T载体中,构建重组体,再对重组质粒进行酶切鉴定,阳性的质粒DNA测序分析后再克隆到穿梭质粒PDC316中,通过Lipofectamine2000的介导和腺病毒包装质粒PBHG共转染至人胚肾HEK293细胞株中,经同源重组后获得重组腺病毒rAdUshSTAT3,应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,以50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度。以阴性为对照,转染到大鼠神经胶质瘤（C6）细胞,MTT法检测C6细胞增殖情况,吖啶橙法检测C6细胞形态的改变,RT-PCR法和Western-blot法观察STAT3基因表达改变,用免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶（ABC）检测C6细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果:获得了带有U6启动子及STAT3反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshSTAT3（1-4）,病毒滴度分别为108.6 TCID50/ml, 109.2 TCID50/ml,108 TCID50/ml, 108.4 TCID50/ml;未转导病毒的细胞相比,rAdSTAT3（1）、rAdSTAT3（2）和rAdSTAT3（3）对C6细胞增殖抑制率在24h、48h和72h分别为20.16%、56.25%、73.18%; 19.76%、52.06%、70.2%;12.93%、49.59%、60.39%。rAdUshSTAT3（1）转导的C6细胞的STAT3 mRNA相对表达量下降了68.82% （p<0.01）,蛋白相对表达量下降了68% （p<0.005）;rAdUshSTAT3（2）转导的C6细胞的STAT3 mRNA相对表达量下降了56.93% （p<0.01）,蛋白相对表达量下降了44% （p<0.01）; rAdUshSTAT3（3）转导的C6细胞的STAT3 mRNA相对表达量下降了56.95% （p<0.01）,蛋白相对表达量下降了38%;与rAdSTAT3（4）相比,rAdSTAT3（1）对C6细胞增殖抑制率在24h、48h和72h分别为18.76%、41.22%和62.35%;rAdSTAT3（2）对C6细胞增殖抑制率在24h、48h和72h分别为18.34%、35.58%和58.16%;rAdSTAT3（3）对C6细胞增殖抑制率在24h、48h和72h分别为11.4%、31.7%和48.33%。rAdUshSTAT3（1）转导的C6细胞的STAT3 mRNA相对表达量下降了65.24% （p<0.01）,蛋白相对表达量下降了56.25% （p<0.01）;rAdUshSTAT3（2）转导的C6细胞的STAT3 mRNA相对表达量下降了51.98% （p<0.01）,蛋白相对表达量下降了37% （p<0.05）; rAdUshSTAT3（3）转导的C6细胞的STAT3 mRNA相对表达量下降了50.95% （p<0.01）,蛋白相对表达量下降了31% （p<0.05）。吖啶橙染色法结果显示rAdUshSTAT3（1-3）转染后的细胞数量明显减少,细胞质萎缩,细胞核相对较大,并且出现凋亡小体。尤其是rAdUshSTAT3（1）转染后最为明显。免疫组化法显示rAdUshSTAT3（1）转染C6细胞后的PCNA表达量明显低于rAdUshSTAT3（4）转染C6细胞后的PCNA表达量（P<0.05）结论:在SH2结构域上选择的干涉靶点上制备的SiRNA抑制神经胶质瘤细胞增殖的效果最强,在CCD和TAD结构域上选择的干涉靶点上制备的SiRNA抑制神经胶质瘤细胞增殖的效果虽然也很好,但弱于在SH2结构域上选择的干涉靶点制备的SiRNA,这为今后针对STAT3的RNA干涉的再深入研究奠定了坚实基础。

论文目录

提要

前言

第一篇文献综述

第一章 STAT3的研究背景及发展趋势

1 JAK-STAT途径

2 STAT蛋白

3 STATs信号转导通路作用机制

4 STAT3

第二章 RNAi的回顾与展望

1 RNAi的发现

2 RNAi的作用机制

3 双链RNA 的构建

4 siRNA的设计

5 siRNA的获得

6 RNAi 的应用

第二篇实验研究

第一章 STAT3腺病毒载体的构建及制备

第一节实验材料

1 主要仪器

2 主要材料及试剂

第二节实验方法

1 引物设计

2 引物合成

3 PCR法获得带有STAT3短发夹环（short hairpin, sh）的HU6启动子

4 HU6 shSTAT3与T载体连接

5 携带HU6sh STAT3的重组腺病毒的包装

第三节实验结果

1 PCR法获得带有STAT3短发夹环（short hairpin, sh）的HU6启动子

2 测序结果

3 重组腺病毒rAdUshSTAT3的包装

第四节小结

第二章 STAT3重组腺病毒转染神经胶质瘤细胞体外实验

第一节实验材料

1 主要仪器设备

2 主要材料和试剂

第二节实验方法

1 rAdUshSTAT3转染神经胶质瘤细胞（C6）细胞

2 转导rAdUshSTAT3的C6细胞STAT3 mRNA水平的检测

3 转导后细胞中STAT3蛋白水平的检测

4 MTT法检测转染后细胞增殖情况的变化

5 吖啶橙法检测转染后细胞形态的变化

6 免疫组织化学方法检测转染后细胞中PCNA蛋白表达情况

第三节实验结果

1 rAdUshSTAT3的转导效率

2 RT-PCR在mRNA水平检测转导后细胞中STAT3mRNA的变化

3 Western-blot在蛋白质水平检测转导后细胞中STAT3变化

4 MTT法检测转导后细胞增殖情况的变化

5 吖啶橙染色法检测转染后细胞形态的变化

6 免疫组织化学法检测转染后细胞PCNA蛋白表达

第四节小结

1 利用MTT法检测C6细胞增殖情况

2 利用RT-PCR在mRNA水平检测转导后细胞中STAT3mRNA的变化

3 利用Western-blot在蛋白质水平检测转导后细胞中STAT3变化

4 吖啶橙染色法检测转染后细胞形态的变化

5 免疫组织化学法检测转染后细胞PCNA表达

第三篇讨论

第四篇结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果

致谢

中文摘要

Abstract

STAT3特异性短干涉RNA抑制神经胶质瘤细胞增殖的研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢