肥大细胞膜机械敏感性离子通道的研究

论文摘要

目的:研究人肥大细胞系（HMC-1）机械敏感性离子通道的电学特性;建立适用于膜片钳记录的外周组织片模型,并进一步对其中原位肥大细胞（mast cell,MC）的机械敏感性进行验证。方法:（1）在光镜显微镜下观察低渗环境导致HMC-1细胞处于高应力状态中对该细胞脱颗粒的影响。（2）利用荧光成像技术,以钙绿（Calcium Green-1 AM）为荧光指示剂,测量低渗环境中HMC-1胞内Ca2+浓度i)的变化。（3）在膜片钳外面朝外（outside-out）和细胞吸附（cell-attached）两种模式下,通过膜片钳记录电极对细胞膜施加正压（+30～+60 cmH2O）或负压（-60～-30 cm H2O）刺激,测量和分析HMC-1上张力激活性（stretch-activated,SA）离子通道的单通道特性。（4）制备大鼠“后三里”穴区（ST36）皮下结缔组织片,用甲苯胺蓝（Toluidineblue,TB）或中兴红（Neutral red,NR）染色观察组织片内MCs的分布,并用膜片钳全细胞（whole-cell）模式对组织片内原位MCs的SA电流进行记录。结果:（1）在230 mOsm/kg的低渗细胞外液中,处于稳定状态的HMC-1细胞会在5～30分钟内出现脱颗粒现象,脱颗粒率为54.9±8.5%（n=4个独立实验,P≤0.01）（mean±SEM）。低渗环境导致HMC-1脱颗粒效应可被Cl-通道阻断剂DIDS和香草精受体TRPV2阻断剂SKF96365抑制,脱颗粒率分别下降到17.7±5.4%（n=4个独立实验,P≤0.05）和22.2±7.9%（n=2个独立实验）。（2） 250 mOsm/kg的低渗细胞外液能增加HMC-1胞内相对钙荧光强度,荧光强度从对照组的100%上升到116.7±3.6%（n=52,5个独立实验,P≤0.01）。TRPV蛋白阻断剂钌红（ruthenium red,RuR）、SKF96365和DIDS能取消或抑制该增强效应,胞内相对钙荧光强度分别下降到100.3±0.9%（n=41,3个独立实验,P≤0.01）、103.7±3.2%（n=30,3个独立实验,P≤0.05）和67.8±5.2%（n=29,4个独立实验,P≤0.01）。（3）在膜片钳实验中,直接的压力牵张可激活HMC-1细胞SA通道。SA单通道电流表现出较强的外向整流性。+100 mV膜电位下的通道电导为55.1±3.4 pS（n=38）。SA通道的开放概率（open probability,Po）具有电压依赖性,在正膜电位下急剧增大;并且具有压力依赖性,Po随着外界压力的增加而增大,在+20 mV膜电位下,达到最大Po值一半所需的压力为26.4 cm H2O。在+60mV膜电位下,通道开放时间分布（open-time distribution）能被3个指数函数拟合,时间常数分别为τ1o=755.1 ms、τ2o=166.4 ms和τ3o=16.5 ms;通道关闭时间分布（closed-time distribution）也能被3个指数函数拟合,时间常数分别为τ1c=661.6 ms、τ2c=253.2 ms和τ3c=5.6 ms。（4） HMC-1细胞的SA单通道活动具有细胞外Cl-浓度（[Cl-]o）依赖性（n=9）。当[Cl-]o由169 mM降低到19 mM后,+100mV膜电位下的电导从44.2±4.4 pS下降到15.1±1.6 pS（P≤0.01）。在+60 mV膜电位下,Po降低到对照组的62.2±13.6%（P≤0.01）。V1/2从5.5±2.7mV上升到45.6±6.9 mV。（5） HMC-1细胞SA单通道活动可被Cl-通道阻断剂DIDS可逆性抑制（n=9）。+100 mV膜电位下的电导从58.5±4.1 pS下降到18.9±7.0 pS（P≤0.01）。+60 mV膜电位下,Po降低到对照组的20.6±1.4%（P≤0.01）。（6）用细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）断裂细胞骨架后发现,激活SA通道所需的压力降低。（7）大量MCs分布在大鼠“后三里”穴区（ST36）的皮下结缔组织片内。和HMC-1类似,大鼠原位MCs也同样表达机械敏感性离子通道。SA通道的全细胞电流表现出外向整流性,并随外界压力的增加而增大。+100 mV膜电位下,由-60 cm H2O激活的SA通道的电导为83.2±25.5 pS,翻转电位约为-35.8 mV。结论:HMC-1脱颗粒效应可被机械刺激激活,DIDS敏感性Cl-通道和TRPV2蛋白参与HMC-1机械敏感性机制,并且[Ca2+]i增加可能是该机制中重要的信号途径之一。这种机械敏感性在大鼠原位MCs上也进一步得到了证实。

论文目录

• 英文缩写对照表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 肥大细胞的生物学特性和功能
• 1.1.1 肥大细胞脱颗粒
• 1.1.1.1 导致肥大细胞脱颗粒的因素
• 1.1.1.2 肥大细胞激活的分子基础
• 1.1.1.3 肥大细胞脱颗粒的信号转导途径
• 1.1.1.4 肥大细胞分泌的活性物质
• 1.1.2 肥大细胞的异质性
• 1.1.2.1 鼠类肥大细胞的异质性
• 1.1.2.2 人肥大细胞的异质性
• 1.1.3 肥大细胞膜离子通道
• 1.1.3.1 人肥大细胞膜离子通道
• 1.1.3.2 鼠类肥大细胞膜离子通道
• 1.1.4 肥大细胞的功能
• 1.2 机械敏感性离子通道
• 1.2.1 机械敏感性通道的种类
• 1.2.1.1 原核细胞上的机械敏感性通道
• 1.2.1.2 真核细胞上的机械敏感性通道
• 1.2.2 机械敏感性通道的门控机制
• 1.2.3 机械敏感性通道的共同特点
• 1.2.3.1 共同的动力学模式
• 1.2.3.2 开放频率的反曲依赖性
• 1.2.3.3 适应现象
• 1.2.4 机械敏感性通道的生理学意义
• 1.3 问题的提出
• 1.4 本文拟解决的问题
• 1.4.1 前期工作
• 1.4.2 本文拟解决的问题及意义
• 第二章 机械力对人肥大细胞系（HMC-1）膜离子通道的调控
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 溶液及试剂
• 2.1.2 细胞培养
• 2.1.3 膜片钳单通道记录
• 2.1.4 胞内钙荧光成像
• 2.1.5 形态学观察
• 2.1.6 机械刺激
• 2.1.7 数据分析
• 2.2 结果和讨论
• 2.2.1 低渗环境对HMC-1脱颗粒的影响
• 2.2.2 低渗环境对HMC-1胞内钙荧光强度的影响
• 2.2.3 压力牵张对HMC-1膜离子通道电流的影响
• 2.2.3.1 outside-out模式下记录到的单通道活动
• 2.2.3.2 cell-attached模式下记录到的单通道活动
• 2.3 本章小结
• 第三章 机械力对大鼠结缔组织原位肥大细胞膜离子通道的调控
• 3.1 实验材料和方法
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 溶液和试剂
• 3.1.3 大鼠"后三里"穴区结缔组织片的制备
• 3.1.4 组织片染色
• 3.1.5 膜片钳全细胞记录
• 3.1.6 机械刺激
• 3.1.7 数据分析
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 大鼠"后三里"穴区皮下结缔组织中肥大细胞的分布
• 3.2.2 低渗环境对大鼠皮下结缔组织中肥大细胞的影响
• 3.2.3 压力牵张对大鼠皮下结缔组织内肥大细胞膜离子通道的影响
• 3.3 本章小结
• 第四章 全文总结和展望
• 4.1 总结
• 4.2 本文的创新之处
• 4.3 工作展望
• 参考文献
• 附录一 试剂及仪器清单
• 附录二 HMC-1的培养
• 附录三 膜片钳记录技术
• 附录四 荧光显微镜的原理
• 附录五 个人简历及发表文章清单
• 致谢