EV71 IgM AlphaLISA检测方法的初步建立

论文摘要

肠道病毒71型（EV71）属于小核糖核酸病毒,感染后可引起手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）,部分患儿可引起一系列中枢神经系统并发症,出现重症病例和死亡病例。因此,建立一种可以快速均相检测EV71 IgM抗体的方法在HFMD早期诊断中显得尤为重要。根据HFMD发病特点,我们建立了具有高敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围、无需洗涤及样本需求量极少等特点的针对EV71 IgM的AlphaLISA检测技术。在本实验中,我们成功的表达纯化了EV71 VP1 1-297及EV71 VP1 1-177重组蛋白,经鉴定后将抗原生物素化。通过ELISA法摸索出生物素化的EV71 VP1的最适量为37.5 ng。优化供体微珠、受体微珠、血清量等实验条件,初步建立了基于VP1的EV71 IgM抗体的AlphaLISA检测方法。我们首先使用ELISA法对10份健康人的血清和30份手足口病病人（30份手足口病病人核酸检测EV71均为阳性）的血清进行评价,健康人的血清中EV71 IgM检测均为阴性,30份手足口病病人的血清中EV71 IgM阳性为16份。然后用建立的AlphaLISA方法体系对上述样本进行检测,检测结果显示：在10个健康人中,AlphaLISA方法检测EV71 IgM也为阴性。在30份手足口病病人血清中,ELISA方法检测出的16份EV71 IgM阳性的样本,AlphaLISA方法检测EV71 IgM均为阳性,然而AlphaLISA方法在ELISA法检测为阴性的血清中检出6个IgM阳性,符合率达到100%,初步建立了均相、快速检测EV71 IgM的平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图或附表清单
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 AlphaLISA概述
• 1.1.1 AlphaLISA方法的原理
• 1.1.2 AlphaLISA方法的研究进展
• 1.2 肠道病毒71型（EV71）概述
• 1.2.1 EV71的起源和引起的疾病
• 1.2.2 EV71的生物学特性
• 1.2.3 病毒颗粒结构
• 1.2.4 基因组结构
• 1.2.5 EV71流行病学特征
• 1.2.6 EV71 IgM抗体检测方法的研究现状
• 1.3 本研究的主要内容和技术路线图
• 1.3.1 研究的主要内容
• 1.3.2 研究的技术路线图
• 2 AlphaLISA检测EV71 IgM方法的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 研究材料
• 2.2.1.1 主要仪器
• 2.2.1.2 主要试剂、耗材
• 2.2.1.3 溶液配制
• 2.2.1.4 研究所用质粒
• 2.2.1.5 分析软件
• 2.2.2 研究方法
• 2.2.2.1 EV71VP1重组蛋白原核表达质粒的构建和鉴定
• 2.2.2.1.1 引物设计
• 2.2.2.1.2 VP1全长1-297基因的获得
• 2.2.2.1.3 VP1全长1-297基因的克隆
• 2.2.2.1.4 目的基因T克隆载体的质粒提取及酶切
• 2.2.2.1.5 VP1全长1-297的表达载体的构建
• 2.2.2.2 EV71VP1全长及N-端重组蛋白的表达、纯化与鉴定
• 2.2.2.2.1 EV71VP1全长及N-端重组蛋白的小量表达鉴定
• 2.2.2.2.2 EV71VP1全长及N-端重组蛋白的纯化
• 2.2.2.2.3 EV71VP1全长及N-端重组蛋白的WB鉴定
• 2.2.2.3 EV71VP1全长及N-端重组蛋白的生物素化
• 2.2.2.4 ELISA法摸索抗原抗体反应的最适浓度
• 2.2.2.5 AlphaLISAEV71 IgM反应条件的摸索
• 2.2.2.6 用ELISA法检测病人血清样品中的EV71 IgM
• 2.2.2.7 用AlphaLISA方法检测病人血清样品中的EV71 IgM
• 3 实验结果
• 3.1 EV71 VP1 1-297全长及N-端重组蛋白表达纯化与鉴定
• 3.1.1 EV71 VP1全长及N-端酶切结果
• 3.1.2 EV71 VP1全长及N-端1-177蛋白SDS-PAGE结果
• 3.1.3 EV71 VP1全长及N-端1-177蛋白WB结果
• 3.2 EV71 VP1蛋白的生物素化
• 3.3 Bio-EV71 VP1的最适浓度确定
• 3.4 AlphaLISA检测EV71-IgM反应体系的建立
• 3.5 EV71 IgM ELISA法检测病人血清
• 3.6 AlphaLISA检测EV71-Ig M方法的初步建立
• 4 实验结果讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 后记或致谢
• 作者简介及读研期间主要科研成果