子痫前期胎盘组织相关蛋白的研究

论文摘要

子痫前期（pre-eclampsia）是妊娠期特有的疾病，为妊娠期高血压疾病的最常见类型，也是导致孕产妇死亡和婴儿病率及死亡率的重要原因之一。目前仍然没有理想的标志物早期诊断子痫前期，且具体的发病机制仍未阐明。蛋白质组学是近年来发展的新技术，主要包含蛋白质分离、蛋白质鉴定和生物信息学三大部分，具有高通量和高灵敏度等优点。胎盘是子痫前期发生的关键环节，直接与子宫蜕膜接触，参与母胎免疫耐受形成及维持妊娠。为进一步阐明子痫前期的发病机制和寻找该病的蛋白标志物，本实验利用蛋白质组学技术，通过比较重度子痫前期患者和正常妊娠胎盘组织的蛋白表达差异，探讨引起子痫前期发生的可能因素，同时寻找子痫前期血清中的标志蛋白，为实现子痫前期的早期诊断提供依据。目的：探讨重度子痫前期和正常妊娠的胎盘组织差异蛋白，筛选出子痫前期胎盘相关蛋白。此外，在血清中寻找与子痫前期胎盘抗原相关的抗体蛋白，进一步检测子痫前期母体外周血中抗体蛋白浓度的变化，为发现特异性标记物提供线索。方法：1收集子痫前期患者、正常孕妇胎盘组织标本，提取胎盘总蛋白，双向凝胶电泳的第一向电泳采用固相pH梯度电泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胎盘组织总蛋白质成份，然后进行硝酸银和考马斯亮蓝染色。通过PDQuest7．4双向电泳图像分析软件对2-DE图谱进行数字化分析匹配与对比，并通过统计学分析方法评价双向凝胶电泳结果。2通过比较子痫前期患者、正常孕妇胎盘组织的双向电泳图谱，筛选出有差异的蛋白质点进行胶内胰蛋白酶解，经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析肽质量指纹图谱，数据库搜索鉴定蛋白质。应用生物信息学技术对差异蛋白进行结构和生物学功能分析和预测。3将双向电泳提取的子痫前期胎盘组织总蛋白转移至PVDF膜上，分别以患者的血清和正常孕妇的血清进行免疫印迹杂交，找出差异反应蛋白质点，筛选出可能引起子痫前期孕妇机体抗原抗体反应的胎盘抗原，经过质谱鉴定出蛋白名称，在大样本的子痫前期患者和正常孕妇的血清标本中应用ELISA方法进行抗体蛋白表达水平的检测。结果：1获得了图像清晰、重复性好的双向电泳图凝胶。2与正常妊娠相比，子痫前期患者胎盘组织丰度差异表达相差2倍以上并经Student’s t-test检验差异有统计学意义的蛋白质点有18个（P＜0．05），其中12个点在子痫前期组表达上调，另6个点表达下调。3质谱鉴定出14个差异蛋白质点，在子痫前期胎盘中上调的蛋白包括纤维蛋白原β链、维生素D结合蛋白、肾小管间质性肾炎抗原样前体蛋白、纤维蛋白原γ链前体、α-1抗胰蛋白酶前体、膜联蛋白Al、α-烯醇酶、Ⅰ型细胞骨架蛋白9、Ⅱ型细胞骨架蛋白1。下调的蛋白包括真核翻译起始因子5A-1、铁蛋白轻链、突变子-2、ATP合酶β亚单位、雌二醇17β脱氢酶1。4免疫印迹技术证实子痫前期患者体内存在抗原抗体反应，对应双向电泳凝胶图找到了胎盘相关抗原位置。5通过胶内酶解消化，质谱分析获得了各个蛋白点的肽谱图和肽段氨基酸序列，经过数据库检索分析后，鉴定出3个胎盘抗原蛋白。子痫前期患者血清中存在纤维蛋白原蛋白β链抗体、热休克蛋白70抗体、线粒体核糖体蛋白的可溶性结构蛋白或抗角蛋白9抗体。6子痫前期患者和正常孕妇的血清中纤维蛋白原蛋白β链抗体、热休克蛋白70抗体蛋白表达水平增加，与蛋白质组学结果基本一致。结论：1子痫前期胎盘组织与正常妊娠胎盘组织存在蛋白表达差异，差异蛋白分别涉及炎症、血栓形成、参与糖酵解的酶类、分子伴侣、信号转导蛋白、细胞骨架蛋白、细胞存活和增殖、凋亡调控蛋白，以及参与细胞内物质转运和能量代谢的酶等。2子痫前期发生发展过程中，血清中存在纤维蛋白原蛋白β链抗体、热休克蛋白70抗体、线粒体核糖体蛋白的可溶性结构蛋白或抗角蛋白9的抗体。3血清中纤维蛋白原β链抗体、热休克蛋白70抗体可能在子痫前期病理过程中起重要作用，有望成为子痫前期标记物候选指标。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、双向电泳技术分离子痫前期胎盘组织差异蛋白
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、蛋白质鉴定-质谱分析与生物信息学研究
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、SERPA技术筛选子痫前期胎盘抗原及抗体
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文及科研情况
• 综述
• 子痫前期早期诊断血清标志物的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢