论文摘要
随着分子生物学理论和技术的进展，特别是在基因载体的构建、靶基因的界定和转基因技术等方面所取得的重要进展，许多因基因结构或表达异常引起的心血管疾病利用基因治疗有望获得根治。本实验选取金属蛋白酶组织抑制因子1（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP1）为目的基因，TIMP1是基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的内源性特异性抑制剂，而MMPs是降解细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）成分的主要酶系。近年研究发现，MMPs／TIMPs平衡失调与动脉粥样硬化、冠状动脉介入术后再狭窄以及心脏重塑、心力衰竭等心血管疾病密切相关。高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，高Hcy血症）是近年来新发现的诱发动脉粥样硬化等心脑血管疾病以及外周血管闭塞性疾病的独立危险因素。高水平同型半胱氨酸（Homocysteic acid，Hcy）诱发上述疾病的病理机制十分复杂，其中主要的一个原因是损伤血管的内皮功能。Hcy可在基因表达水平影响血管内皮细胞MMPs及TIMPs的表达，促进ECM的降解，损害血管内皮的功能进而降低粥样硬化斑块的稳定性，是高Hcy血症促发动脉粥样硬化发生发展和诱发斑块破裂的重要机制之一。以腺病毒为载体介导TIMPs到血管内皮细胞，调节ECM的生成和降解，从而调节粥样斑块的稳定性可能成为冠心病基因治疗的新方法。本实验以hTIMP1为目的基因，以腺病毒为基因载体，首先构建携带hTIMP1的重组腺病毒pAd-TIMP1及其对照重组腺病毒pAd-Track，然后将其感染体外培养的人脐静脉内皮细胞CRL-1730，并加入Hcy进行刺激，初步研究了内皮细胞中TIMP1过表达时，生理浓度和病理浓度Hcy对内皮细胞MMP9和MMP1 mRNA的表达情况。为基因治疗动脉粥样硬化，稳定粥样斑块提供靶基因的线索，并为后续在体实验提供基础理论依据。第一部分携带hTIMP1的重组腺病毒pAd-hTIMP1和对照重组腺病毒pAd-Track的构建目的：应用分子生物学技术构建携带hTIMP1目的基因的重组腺病毒pAd-hTIMP1。方法：pAd-hTIMP1重组腺病毒的构建分4步进行。1．构建PUC-hTIMP1。从人心肌细胞中获取RNA，RT-PCR扩增得到目的基因hTIMP1全长片段，电泳胶回收备用。T4 DNA连接酶催化其与pUCm-T载体进行连接，转化感受态的E．Coli JM109，经蓝白斑筛选的白色菌落扩增培养，提取质粒PUC-hTIMP1，并用相应的酶进行酶切鉴定。2．构建pAd-Track-CMV-hTIMP1。BglⅡ和NotⅠ双酶切pAd-Track-CMV和PUC-hTIMP1，胶回收hTIMP1目的基因片段和开环质粒，用T4 DNA连接酶催化两片段进行连接，转化感受态的E．Coli JM109，构建质粒pAd-Track-CMV-hTIMP1，并用BglⅡ和NotⅠ双酶切进行鉴定。3．构建pAd-hTIMP1。用PemⅠ酶切pAd-Track-TIMP1，用电转化法将线性质粒转入E．coliBJ5183，与pAdEasy-1进行同源重组，构建质粒pAd-hTIMP1。BamHI及PacⅠ酶切鉴定，重组正确的质粒转化感受态的E．Coli DH5α进行大量扩增。应用试剂盒进行大量提取。PacⅠ酶切使其线性化，待转染293T细胞。4．293T细胞内包装重组腺病毒。脂质体转染法转染线性化的质粒pAd-hTIMP1到293T细胞中，进行重组腺病毒的包装。并用首次采集的病毒液感染293T细胞2-3次，得到大量扩增的腺病毒，CsCl超速离心纯化腺病毒，OD260测定病毒滴度，并用透射电镜进行观察。结果：本实验利用分子生物学技术构建了过渡质粒PUC-hTIMP1，穿梭质粒pAd-Track-CMV-hTIMP1，最终获得了质粒pAd-hTIMP1，PCR及经DNA测序证实重组子DNA序列正确无误。293T细胞中包装并纯化后获得的病毒滴度可达到1.9×1012v．p．／ml。PCR扩增病毒可得hTIMP1特异条带，电镜观察病毒颗粒均匀，病毒大小80-90nm，呈多面体形态。重组AdV载体包装成功，为后继体外细胞实验和在体动物实验奠定了基础。第二部分内皮细胞中过表达hTIMP1对Hcy诱发内皮细胞损伤的保护研究目的：利用携带hTIMP1的重组腺病毒感染人脐静脉内皮细胞进行体外实验，研究不同浓度Hcy刺激下，基因转移hTIMP1对内皮细胞的保护作用。方法：1．确定重组腺病毒pAd-hTIMP1和pAd-Track感染CRL-1730的感染复数（MOI），以MOI=50进行腺病毒的感染。2．分组。根据加入重组腺病毒的不同分为三组：空白对照组，Track对照组和基因治疗组。又根据以上各组中加入Hcy的不同剂量分成亚组：空白剂量（Hcy0mmol／L），生理剂量（Hcy 0.01mmol／L）和病理剂量（Hcy 0.1mmol／L）。每亚组均设8个复孔，Hcy刺激后6小时和24小时各收集4个复孔中的细胞。3．提取内皮细胞中的RNA，RT-PCR法扩增目的基因hTIMP1、MMP1及MMP9mRNA，测量目的基因扩增条带与内参基因（GAPDH）扩增条带的灰度值。明胶酶谱法测定24小时细胞培养液中明胶酶的表达。结果：本实验发现，体外培养的内皮细胞在基础状态下即可表达一定量的MMP1、MMP9和TIMP1 mRNA。加入不同浓度的Hcy刺激之后，MMPs和TIMP1的表达量有所变化。生理浓度Hcy可使TIMP1 mRNA的表达升高（p＜0.05），病理浓度Hcy对TIMP1 mRNA的表达没有明显影响，但可使MMP1和MMP9 mRNA的表达升高（p＜0.05）。pAd-hTIMP1重组腺病毒感染CRL-1730后，TIMP1 mRNA的表达升高（p＜0.05），MMP1 mRNA和MMP9 mRNA的表达降低（p＜0.05）。病理浓度Hcy刺激时，pAd-hTIMP1治疗组TIMP1 mRNA表达升高（p＜0.05），MMP1和MMP9 mRNA的表达降低（p＜0.05）。结论：1．本研究应用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带人TIMP1目的基因的重组腺病毒pAd-hTIMP1和对照重组腺病毒pAd-Track。2．Hcy可以促进体外培养的人脐静脉内皮细胞（CRL-1730）MMP1和MMP9表达升高，pAd-hTIMP1感染CRL-1730使hTIMP1过表达可以抑制病理浓度Hcy刺激时MMP1和MMP9 mRNA的表达升高，从而对抗Hcy对内皮细胞的损伤作用。
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