杠柳新苷T的分离及多克隆抗体的制备

论文摘要

从天然产物中筛选具有生物活性的先导化合物并以其为探针发现新靶标，是当前新农药创制的重要途径。基于这一思路，本研究在生物活性的追踪下，对杠柳Periplocasepium根皮杀虫活性成分进行了较为系统的研究。并选择具有较高杀虫活性的杠柳新苷T进行多克隆抗体的制备，为其作用靶标的定位研究奠定基础。主要研究结果如下：1．在生物活性追踪方法的指导下，采用硅胶柱层析分离和高效液相色谱（HPLC）切分，从杠柳根皮的甲醇提取物中分离出6个化合物，通过波谱学（MS、2D-NMR和1D-TOCSY等）方法进行结构鉴定，其分别为3个已知化合物：杠柳新苷D、杠柳新苷E和杠柳新苷F；3个未见报道的新化合物：杠柳新苷P、杠柳新苷T和杠柳新苷U。生物活性测定结果表明，杠柳新苷D、F、P和T对3龄粘虫Mythimna separata和小菜蛾Plutella xyllostella具有毒杀活性。对3龄粘虫48h的胃毒致死中浓度（LC50）分别为0.39、0.34、0.11和0.07mg/mL，对小菜蛾48h的胃毒LC50值分别为1.21、1.39、0.89和0.35mg/mL。中毒症状观察表明：其中毒症状与试虫对杠柳毒素NW的中毒症状相同，推测这些杠柳新苷类化合物可能主要作用于昆虫的消化系统。2．以高活性化合物杠柳新苷T为起始反应物，与琥珀酸酐反应生成杠柳新苷T的衍生物（半抗原）；采用碳二亚胺法分别将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA）进行偶联，制备杠柳新苷T的人工抗原。利用液相色谱（HPLC-ELSD）、质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）对杠柳新苷T的衍生物进行表征，并用紫外扫描法（UV）和红外光谱（IR）对人工抗原进行鉴定，采用2,4,6-三硝基苯磺酸比色法（TNBS）对人工抗原的结合比进行测定。结果表明，成功制备出杠柳新苷T的半抗原和人工抗原，半抗原和载体蛋白（BSA和OVA）的结合比分别为5:1和7:1。3．用杠柳新苷T的人工抗原（hapten-BSA）免疫8周龄Balb/c小白鼠。采用酶联免疫法（ELISA）测定抗体效价，并对ELISA检测条件进行初步优化；选择与杠柳新苷T结构相似的杠柳新苷P和E进行交叉反应率测定。结果表明：最佳包被抗原质量浓度为10μg/mL，抗体最高效价为1600。抗血清竞争性抑制试验表明，制备的抗体对杠柳新苷T具有很强的亲和性，其半数抑制浓度（IC50）为12.4294μg/mL。抗体与杠柳新苷P和E的交叉反应率分别为25.6%和8.6%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物源农药的研究和应用
• 1.1.1 植物源农药结构优化研究
• 1.1.2 植物源杀虫剂作用机理研究
• 1.2 农药免疫分析技术
• 1.2.1 半抗原的制备
• 1.2.2 人工抗原的制备
• 1.2.3 抗体的制备
• 1.2.4 农药免疫分析技术的应用
• 1.3 杠柳植物的研究概况
• 1.3.1 杠柳植物概况
• 1.3.2 杠柳植物的杀虫活性
• 1.4 论文设计的思路
• 第二章 杠柳杀虫活性成分的分离
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物样品
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 试虫
• 2.2 分离方法
• 2.2.1 活性成分的提取
• 2.2.2 活性成分的分离
• 2.2.3 生物活性的测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 化合物的结构鉴定
• 2.3.2 化合物杀虫活性的测定
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 杠柳新苷 T 人工抗原的制备与鉴定
• 3.1 供试材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 半抗原的合成与鉴定
• 3.2.2 人工抗原的合成与鉴定
• 3.2.3 人工抗原结合比的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 半抗原的鉴定
• 3.3.2 人工抗原的鉴定
• 3.3.3 人工抗原偶联比
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 杠柳新苷 T 多克隆抗体的制备
• 4.1 供试材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 实验动物
• 4.1.4 溶剂配置
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 抗原的乳化
• 4.2.2 小鼠免疫
• 4.2.3 抗体效价测定
• 4.2.4 抗血清亲和性测定
• 4.2.5 抗血清交叉反应性测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 抗体效价
• 4.3.2 抗血清和包被抗原工作浓度的确定
• 4.3.3 抗血清亲和性测定
• 4.3.4 抗体与杠柳新苷类化合物的交叉反应
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介